RAW264.7 대식세포에서 유리규산에 의한 Nuclear Factor-κB 활성화 기전에 관한 연구

Abstract

It was previously reported that protein tyrosine kinase (PTK) plays an important role in silica-induced activation of NF-κB in macrophages. In addition, phosphoinositol3-kinase (PI3-kinase) has been reported to play an important role in NF-κB activation by several stimulants. The question is raised whether PTK stimulation and NF-κB activation in silica-stimulated RAW264.7 macrophages are directly connected through tyrosine phosphorylation of IκB-α, So whether PI3-kinase is involved in NF-κB activation through the binding with tyrosine-phosphorylated IκB-α. Results indicate that stimulation of macrophages with silica led to NF-κB activation through tyrosine phosphorylation without serine phosphorylation. Specific inhibitors of protein tyrosine kinase, such as genistein and tyrophostin AG126 prevented tyrosine phosphorylation of IκB-α in response to silica. Amount of IκB-α protein was not changed for up to 60 min after silica stimulation. Moreover, inhibition of proteasome proteolytic activity did not affect NF-κB activation by silica. PI3-kinase subunit of p85 bound with tyrosine-phosphorylated IκB-α in silica-stimulated RAW264.7 macrophages. Specific inhibitors of PI3-kinase, such as wortmannin and LY294002, supressed dose-dependently NF-κB act ivation induced by silica. The data suggest that PI3-kinase activity was involved in silica-induced NF-κB activation not only p85 but also p110 subnuit of PI3-kinase activity. Antioxidants, such as superoxide dismutase (SOD), N-acetylcysteine (NAC), and pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), blocked silica-induced tyrosine phosphorylation of IκB-α and PI3-kinase activity, suggesting reactive oxygen species (ROS) may be important regulatory molecules in NF-κB activation by tyrosine phosphorylation of IκB-α and mediating PI3-kinase activation. The data suggest that tyrosine phosphorylat ion of IκB-α represents proteasome proteolytic activity-independent mechanism of NF-κB activation and both p85 and pll0 subuntis of PI3-Kinase are involved in tyrosine phosphoryiation dependent NF-κB activation. This proposed mechanism of NF-κB activation induced by silica could be used as a target for development of antiinflammatory and antifibrotic drugs.;대식세포에서 유리규산에 의해 유도되는 NF-κB 활성화에 protein tyrosine kinase (PTK)가 연관되어 있음이 보고된바 있다. 또한 여러 종류의 자극제에 의한 NF-κB 활성화에 phosphoinositol 3-kinase (PI3-kinase)가 중요한 역할을 한다고 알려진바 있다. 따라서 본 연구에서는 RAW264.7 대식세포를 유리규산에 노출 시킨 후 PTK 활성과 NF-κB 활성화가 IκB-α군거 tyrosine기 인산화를 통하여 직접적으로 연관되어 있는지, 만약 연관되어 있다면, PI3-kinase가 tyrosine이 인산화 된 IκB-α와의 결합을 통하여 NF-κB 활성에 연관되어 있는지에 대하여 연구하였다 RAW264.7 대식세포에 유리규산 노출 시 NF-κB의 활성화는 IκB-α의 serine 인산화가 아닌 tyrosine 인산화를 통해 NF-κB 활성화를 유도하였다. 유리규산에 의한 IκB-α의 tyrosine 인산화는 PTK 특이 억제제인 genistein과 tyrophostin AG126에 의해 억제되었다. 유리규산 노출 후 60분 동안 IκB-α 단백질량의 변화는 거의 없었다. 뿐만 아니라 proteasome의 단백질 분해 효과는 유리규산에 의한 NF-κB 활성에 영향을 미치치 않았다. 유리규산에 노출된 대식세포에서 PI3-kinase의 P85α subunit가 tyrosine 인산화 된 IκB-α와 결합하였으며, PI3-kinase 특이억제체인 wortmannin 또는 LY294002 전처치 시 유리규산에 의한 NF-κB활성이 용량 의존적으로 억제되었다. 이러한 결과는 PI3-kinase의 p85α뿐 아니라 p110 subunit도 유리규산에 의한 NF-κB 활성화 과정에 연관되어 있음을 암시한다. 항산화제인 superoxide dismutase (SOD), N-acetylcystein (NAC), pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)는 유리규산에 의해 유도되는 IκB-α tyrosine 인산화와 PI3-kinase 활성화를 억제하였다. 따라서 활성산소종은 유리규산 노출 시 유도되는 IκB-α의 tyrosine 인산화 및 PI3-kinase 활성화를 유도함으로써 NF-κB 활성화에 중요한 조절인자 역할을 한다고 제안 할 수 있다. 위의 결과들은 RAW264.7 대식세포에서 유리규산 노출로 초래되는 IκB-α의 tyrosine 인산화는 proteasome에 의한 단백질 분해 과정 없이, NF-κB의 활성화를 유도하며, PI3-kinase의 p85와 pl10 subunits가 tyrosine 인산화 의존적인 NF-κB 활성화에 연관되어 있음을 제시한다. 본 연구를 통해 제안되어지는 NF-κB의 활성화기전을 항염증 및 항섬유증 치료를 위한 새로운 약품 개발에 응용할 수 있을 것이다.