흰쥐에서 편측 반회후두신경 재지배후 neuronal Nitric Oxide Synthase(nNOS)의 발현과 후두기능회복과의 관계

Abstract

Nitric Oxide(NO)는 신경 조직, 심혈관 조직, 면역 조직에서 발견되는 유리라디칼(free radical)로서 nitric oxide synthase(NOS)에 의하여 생성된다. 최근 세가지 종류의 NOS가 발견되었는데 neuronal isoform(nNOS, NOS-I) endothelial isoform(eNOS, NOS-Ⅲ), inducible isoform(iNOS, NOS-Ⅱ)이다. 이들중 nNOS는 중추 및 말초신경계의 여러 신경세포들에서 발견되고 있지만 말초신경의 운동신경세포(motoneuron)에서는 정상적으로는 존재하지 않는다고 한다. 여러 저자들이 이렇게 nNOS가 정상적으로는 존재하지 않거나 아주 소량으로 존재하는 운동신경세포에서 축삭의 손상 후에 nNOS의 발현이 증가됨을 다양한 형태학적인 연구를 통해 보고하고 있다. 본 교실에서는 골절된 뼈의 치유에 도움을 주고 절단된 말초신경의 재문합후에 신경재생을 촉진시킨다고 알려져 있는 pulsed electromagnetic stimulation(PEMS)을 흰쥐에서 반회후두신경 재문합후 적용한 결과, 후두의 기능회복을 조기에 촉진하는 역할을 한다는 것을 확인한 바 있었다. 따라서 본 연구에서는 PEMS를 이용하여 반회후두신경의 마비후 후두기능이 회복된 쥐의 모델을 만들어 기능이 회복된 경우와 회복되지 않은 경우에 신경 절단부에서 nNOS의 발현 양상을 면역조직화학적 염색(immunohistochemistry)을 통하여 비교해 보고자 하였다. 이에 저자들은 84마리의 수컷 Sprague-Dawley계 흰쥐를 사용하여 좌측 반회후두신경을 자르고 재문합하여 무작위로 두군으로 나누었다. 후두기능이 회복된 쥐의 모델을 얻기 위하여 간헐적인 전자기장 자극은 Helmholtz coil을 장치한 원통을 이용하여 PEMS를 시행하였고(3 hr/day, 5 days/week for 12 weeks) 나머지군은 PEMS를 제외한 모든 조건을 동일하게 유지하였다. 기능회복여부를 알기 위해 수술전과 수술후 매주 후두내시경을 실시하였다. 실험과정이 끝난 12주후 흰쥐를 희생시키기전에 근전도를 통해 병변쪽인 좌측의 후윤상피열근과 정상쪽인 우측의 후윤상피열근의 호흡시 활동전위가 일치하는지를 관찰하여 전기생리학적 기능회복의 정도를 다시 한번 확인하였다. 면역조직화학적 염색을 위해 PEMS군에서 3주째 기능이 회복되지 않은 1마리의 쥐와 PEMS군과 자극을 주지 않은 군에서 4주와 12주에 각각 기능이 회복된 흰쥐 1마리, 기능이 회복되지 않은 흰쥐 1마리씩 총 9마리를 이용하였다. 좌측 반회후두신경 접합부에서 근위부 4㎜와 동측의 Nodose 신경절(ganglion)을 이용하여 nNOS와 S-100에 대한 면역조직화학적 염색을 시행하였다. PEMS군에서는 20마리 (63%)의 쥐가 자극을 주지 않은 군에서는 5마리 (17%)의 쥐가 후두기능이 회복되었고 이것은 통계적으로 의미있는 차이를 보였다. nNOS에 염색되는 신경세포는 기능이 회복된 쥐에서 더 많았으나 통계학적으로 의미는 없었다. PEMS군과 자극을 주지 않은 군간에 nNOS염색의 정도는 차이가 없었으며 염색의 강도는 12주째에서 보다 3주와 4주째의 신경세포에서 더 강하게 나타났다. 결론적으로 본 연구자는 이러한 실험 결과를 통해 nNOS가 반회후두신경의 손상후 신경의 재생과 기능회복에 영향을 미치며 이는 신경의 재생을 돕는 방향으로 작용함을 알 수 있었다.;Nitric oxide (NO) is a short-lived molecule with messenger and cytotoxic functions in nervous, cardiovascular and immune systems. NO is produced by a nitric oxide synthase (NOS) which is an enzyme to oxidize the amino acid L-arginine to form L-citrulline and NO. Among the three distinct NOS isoforms, the neuronal isoform is expressed in small, discrete neuronal populations of CNS and PNS. Axonal injury in adult animals results in a dramatic NOS up-regulation In many types of central and peripheral neurons which normally lack the enzyme or express it only at very low levels. In previous study, we confirmed the efficacy of PEMS on the early functional recovery in rats with surgically transected and reanastomosed recurrent laryngeal nerve. Therefore, after we obtained functionally recovered rats using PEMS in this study, we studied to evaluate the expression of nNOS through the analysis of the difference between functional recovery group and non-recovery group in the recurrent laryngeal nerve. Using 84 healthy male Sprague-Dawley rats, transections and primary anastomosis were peformed on their left recurrent laryngeal nerves. Rats were then randomly assigned to 2 groups. The rats in group A (n=42) received PEMS by placing them in custom cages equipped with Helm-holz coils (3 hr/day, 5 day/wk, for 12 wk). The rats in group B (n=42) were handled the same way as the group A, except that they did not receive PEMS. Laryngo-videoendoscopy was performed before and after surgery and followed up weekly. Laryngeal EMG was obtained In both PCA and TA muscles. Immunohistochemisty staining using monoclonal anti-neuronal nitric oxide synthase (nNOS) antibody was performed to detect nNOS in recurrent laryngeal nerve and nodose ganglion. 20 rats (63%) in group A and 5 rats (17%) in the group B showed recovery of vocal fold motion. The number of NOS-positive cells was increased in functionally-recoverd rats. NOS-staining intensity was reduced 12 weeks after nerve injury. The difference between PEMS group and non-stimulated group was not found. This study shows that nNOS may have a beneficial effect on nerve regeneration and functional repair.