자궁경부암에서 Annexin I 및 Thymosin β4의 발현에 관한 연구

Abstract

Annexin은 칼슘 의존성 인지질 결합 단백질 군으로 세포의 조절 기전과 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. 이들 annexin 중 annexin I은 세포증식의 조절인자로서 세포의 증식, 맥관형성과 암세포의 침윤을 자극한다고 알려져 있다. Thymosin β4는 세포의 이동을 촉진시키고 내피세포의 분화 및 신생혈관 생성과정에 관여한다고 알려진 일종의 사이토카인으로써 최근 정상세포에 비하여 암세포에서 발현이 증가되는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 연구에서는 정상 자궁경부와 전암 단계인 자궁경부 상피내종양 및 자궁경부암 조직에서 annexin I 및 thymosin β4 mRNA와 단백질의 발현의 차이를 연구하였고 임상 양상에 따른 발현을 분석하였다. 또한 자궁경부암 세포를 배양한 후 thymosin β4 peptide를 처리하여 annexin I의 발현양상의 변화를 연구함으로써 annexin I와 thymosin β4의 발현이 자궁경부암에 중요하게 관여하는지를 알아보고, 자궁경부암에서의 thymosin β4 및 annexin I의 상호작용을 규명하고자 하였다. 1999년 9월부터 2002년 3월까지 이화의료원 부속 목동병원을 내원한 환자 중 침윤성 자궁경부암으로 진단 받은 환자 33예와 자궁경부 상피내종양으로 진단받은 환자 10예에서 경부암과 상피내종양 조직을 채취하였고, 다른 부인과 양성질환으로 수술한 환자 11예에서 정상자궁경부 조직을 얻었으며 자궁경부암 세포주인 SiHa 세포주를 배양하여 연구 대상으로 하여, 조직과 세포에서 QC PCR과 western blot analysis로 annexin I, thymosin β4의 발현을 측정하였다. 또한 SiHa 세포주에 thymosin β4 peptide를 처리한 후 처리전후의 annexin의 발현변화를 관찰하였으며, 경부암 세포내에서의 thymosin β4과 annexin의 발현양상 및 변화를 보기위해 thymosin β4 peptide를 처리전후의 SiHa 세포에서 면역형광염색을 시행하여 confocal microscope로 thymosin β4과 annexin의 발현위치와 정도를 함께 관찰하였다. 자궁경부암에서 thymosin β4와 annexin I mRNA의 발현은 정상자궁경부, 자궁경부상피내종양에 비해 통계적으로 유의하게 높은 발현을 나타냈으며, thymosin β4와 annexin I 단백질도 정상자궁경부보다 자궁경부암에서 높게 발현되었다. Thymosin β4와 annexin I mRNA의 발현은 다른 예후인자와 유의한 상관관계가 없었으나, thymosin β4와 annexin I 단백질의 경우 임상병기가 진행될수록 발현이 증가하는 양상을 보였다. Thymosin β4 peptide를 처리한 SiHa 세포에서는 처리하지 않은 세포보다 annexin I의 발현이 약간 증가하는 소견을 보였으며, 면역형광 염색된 SiHa 세포에서도 thymosin β4 peptide가 처리된 경우가 처리하지 않은 경우보다 annexin I의 발현이 약간 핵내에서 증가하는 소견을 보여주었다. thymosin β4는 주로 핵주위 세포질에서 발현되고 있는 데 반해 annexin I은 주로 핵 내에서 많이 발현되었으며 thymosin β4를 처리한 경우 thymosin β4의 강한 발현이 핵내로 이동되면서, annexin I 발현도 핵내로 동시에 증가하는 소견을 보여 thymosin β4과 annexin I의 colocalization 정도가 증가함을 알 수 있었다. 결론적으로 annexin I와 thymosin β4는 침윤성 자궁경부암에서 증가하며 특히 진행된 자궁경부암에서 이 두 인자가 증가함으로써 자궁경부암의 진행에 관여할 것으로 생각되며 자궁경부암의 진행에 관여시에도 thymosin β4가 annexin I를 조절하는 상호작용을 일으켜, 자궁경부암의 침윤 및 전이에 관여한다고 할 수 있겠다. 앞으로 계속적인 연구를 통해 침윤성 자궁경부암에서 annexin I 및 thymosin β4의 작용기전과 그 상호작용을 규명한다면 침윤성 자궁경부암의 진행과 전이과정을 예측하는데 유용할 것이며 자궁경부암의 치료에도 효과적인 표적이 될 수 있을 것으로 생각된다.;Annexin is calcium binding protein that is essential for actin-dependent vesicle transport. Annexin stimulates cell proliferation, angiogenesis, cancer invasion, and metastasis. Strong overexpression of annexin I was found in different types of cancers. Thymosin β4, a small acidic peptide, binds to actin and plays a role in actin sequestering. It also promotes cell migration, angiogenesis and metastasis of tumor. The aim of this study was to determine the expression of annexin I and thymosin β4 in invasive cervical cancer including normal cervix and CIN. Normal cervical tissues were obtained from healthy women(n=11), from patients with cervical intraepithelial neoplasia(CIN, n=10), and from patients with cervical cancer(n=33). The expressions of annexin I and thymosin β4 mRNA and protein were examined by quantitative competitive-PCR and western blot analysis. SiHa cell lines were cultured and treated with thymosin β4 peptides. The expressions or annexin I and 31thymosin β4 was done with double immunofluorescent staining. Confocal microscopic findings of thymosin β4 and annexin was observed in thymosin β4 nontreated and treated SiHa cells. The results were as follows : 1. The expressions of thymosin β4 mRNA and protein in cervical cancer were higher than that in normal cervix(p<0.05). 2. The expressions of annexin I mRNA and protein were higher than that in normal cervix and in CIN(p<0.05). 3. Thymosin β4 and annexin I mRNA expressions were not significantly correlated with cervical cancer stage, or size of the tumor(p>0.05). But thymosin β4 and annexin I protein expressions were increased according to the cancer stage. 4. The expression of annexin I was slightly higher in thymosin β4 treated SiHa cells than in nontreated SiHa cells. 5. SiHa cells treated and nontreated by thymosin β4 peptides were observed using a laser confocal microscope. Thymosin β4 was expressed in the perinuclear cytoplasm and annexin I in the nucleus. In thymosin β4 treated SiHa cells, localization of annexin I was increased in the nucleus and colocalization of thymosin β4 and annexin I was increased in the nucleus. In conclusion, our results suggest that overexpression of thymosin β4 and annexin I may play roles in progression of invasive cervical cancer. Thymosin β4 upregulates annexin I localization in the nucleus by colocalizing with annexin I in invasive cervical cancer. Therefore, thymosin β4 and annexin I may be biologic markers in detecting the progression of invasive cervical cancer, and their interaction is important in invasive cervical cancer.