Berberine이 keloid fibroblast의 TGF-β, type1 collagen 및 fibronectin 생성에 미치는 영향에 관한 연구

Abstract

Keloids commonly occur after dermal injury as the result of a dysregulated process of wound healing. Keloids are characterized by overproduction of extracellular matrix and abnormal proliferation of fibroblasts. Keloid formation has been ascribed to altered growth factor regulation, abberant collagen turnover, genetics, immune dysfunction, and sebum reaction. Many treatments of keloids -surgical excision, radiation therapy, intralesional steroid injection, laser, silicone gel and pressure therapy are not so effective. Treatment of keloids with intralesional triamcinolone often makes unsatisfactory outcome. Recently, clinicians conduct the researches to look for treatment of keloids. Berberine, an isoquinoline alkaloid, has a wide range of pharmacologic effects. Berberine is reported as being anti-inflammatory, immunosuppressive, anti-carcinogenic, anti-microbial and antioxidant. The aim of this study was to evaluate the effect of berberine on synthesis of TGF-β, type 1 collagen and fibronectin, as well as on proliferation of fibroblasts derived from keloid. Keloid fibroblasts were obtained from keloid specimens on the ear lobe and cultured. Cells were treated with berberine at different concentrations for 24 hours and harvested. The inhibitory effects of berberine on fibroblasts proliferation were assayed using cell viability assay with cell counting kit-8. TGF-β, type 1 collagen, and fibronectin mRNA were detected with reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) method and analyzed with computerized densitometry. The effects of berberine on fibronectin were assayed using Western blot assay and immunofluorescence stain. Berberine significantly inhibited proliferation of keloid fibroblasts in a dose-dependent manner and effective concentration was from 500μM to 1mM. Also, berberine significantly inhibited the expression of TGF-β, type 1 collagen, and fibronectin from 500μM. These data suggest that berberine might be a good potent for treatment of keloid via inhibition of both proliferation and synthesis of TGF-β, type 1 collagen and fibronectin.;켈로이드는 피부 손상시 부적절한 조절반응으로 인해 세포외 기질 특히 교원질이 과다 축적되어 원래의 상처의 범위를 넘어서는 흉터를 형성하는 특이한 질환이다. 켈로이드의 병리기전은 TGF-β와 같은 성장인자의 이상, 콜라겐 생성과 분해 간의 불균형, 장력, 피지반응, 면역반응 등이 알려져 있다. 켈로이드 치료법에는 수술적 치료, 방사선 조사법, 실리콘 젤, 약물치료 등 여러 가지가 있으나, 일반적인 흉터 치료 방법인 수술의 경우 재발이 흔하고 오히려 더 커지는 경우도 있어 많이 사용되지 않는다. 켈로이드 치료에 주로 사용되는 트리암시놀론은 모세혈관 확장증, 피부 위축 및 함몰, 색소탈색 등 원치 않는 부작용이 많고, verapamil의 경우 부작용은 적으나, 콜라겐 분해 억제가 주요 기전이라서 효과가 적다. 그 외에 시도된 약물들도 효과가 적거나 재발이 흔하거나 부작용이 심하여 사용하기가 어려워, 새로운 치료제를 찾으려는 시도가 계속 이어지고 있다. Berberine은 황백 (Phellodendron amurense), 황련 (Coptis chinensis) 등의 식물에서 추출된 isoquinoline 알칼로이드로 중국 및 한국에서 한약재로 오랜 기간 이용되어 왔으며 다양한 약리작용을 가지고 있다. 염증반응을 강력히 억제하며, 면역억제, 항산화 작용과 넓은 항균 활성도, 암세포 증식 억제 작용이 있고, 낮은 독성 때문에 고농도로 이용되어 왔다. 켈로이드의 병리기전을 고려할 때, berberine이 그 기전을 효과적으로 차단할 수 있을 것으로 가정하여, berberine 이 켈로이드 섬유모세포의 증식과 콜라겐, 섬유결합소 생성에 미치는 영향과 TGF-β의 합성에 대한 영향을 보고자 연구하였다. 실험 방법은 귓볼 켈로이드 조직에서 켈로이드 섬유모세포를 추출 배양하여 1μM부터 1mM 사이 여러 농도의 berberine 혼합배지에 24시간 배양하여 검사하였다. 세포 생존성 실험을 위해 CCK-8 kit을 이용하여 세포 증식과 세포 독성을 검사하였고, 광학현미경으로 berberine에 의한 세포의 증식 억제, 형태 변화 등을 관찰하였다. 역전사 중합효소 연쇄반응으로 TGF-β, 1형 콜라겐, 섬유결합소의 mRNA 발현을 측정하였으며, western blot으로 섬유결합소의 생성을, 면역형광염색으로 섬유모세포를 염색하여 섬유결합소의 형성정도를 확인하였다. 실험 결과 berberine 투여 하에 농도 의존적으로 켈로이드 섬유모세포의 증식이 감소하였으며, berberine 농도 200μM부터 감소하기 시작하여 500μM에서 뚜렷한 세포 증식 억제효과가 나타냈다. 광학 현미경 상에서 세포 증식이 유의하게 감소하는 것을 볼 수 있었으며, 세포의 형태 변화는 관찰되지 않았다. 역전사 중합효소 연쇄반응 결과, 1형 콜라겐과 TGF-β, 섬유결합소의 mRNA 발현은 berberine 농도 500μM 이상에서 뚜렷하게 감소하였다. western blot과 면역형광 염색으로 확인한 섬유결합소 생성도 500μM 이상의 농도에서 감소하는 것을 볼 수 있었다. 결론적으로 berberine은 약 500μM 이상의 농도에서 뚜렷하게 켈로이드 섬유모세포의 증식을 억제하고, TGF-β 생성을 억제하며 콜라겐과 섬유결합소 생성을 억제하였다. 또한 berberine은 항염증 효과와 세포 매개성 면역 억제 작용, 항산화제 작용이 있어 섬유모세포 뿐 아니라 주변 염증세포에도 영향을 미쳐 효과를 나타낼 수 있을 것으로 보이며 특히 고농도에서도 부작용이 거의 없기 때문에, 켈로이드 치료제로서의 가능성이 있다고 생각된다.