Neuroprotective effects of WKL-006 : its cAMP-dependent antimigratory activity.

Abstract

We investigated the effect of WKL-006 on in vivo ( MCAO ) and in vitro (migration, inflammation/glucose deprivation, NMDA toxicity, inflammation) model; Here we report the anti-migratory effect of WKL-006 in microglial cells. Our preliminary experiments showed that WKL-006 increased the level of cAMP in microglial cells. Thus, we tested whether the anti-migratory effect of WKL-006 was caused by the elevated level of cAMP. Forskolin, a well-known adenyl cyclase activator, caused inhibition of MCP-1-induced migration in cultured microglial cells. A PKA-specific inhibitor H89 and an adenyl cyclase inhibitor SQ22536 largely prevented the anti-migratory effect of WKL-006. But, WKL-006 did not inhibit the production of NO, TNF-α and MCP-1 in LPS-treated microglial cells. RT-PCR showed that WKL-006 did not alter the mRNA expression of iNOS, pro-inflammatory TNF-α and IL-1β, and anti-inflammatory TGF-β. However, WKL-006 completely diminished the migration of microglial cells caused by a chemokine MCP-1 at nanomolar concentrations. WKL-006 significantly reduced the cerebral ischemic injury caused by 2-hour middle cerebral artery occlusion followed by 24-hour reperfusion. Further studies are required to elucidate the relationship between the inhibitory effect of WKL-006 on microglial cell migration and ischemic injury. In the cerebral ischemic penumbra, progressive deterioration eventually leads to death of glial cells. The exact mechanism for the death of glial cells is unclear. WKL-006 caused a attenuation of the increased death in glucose-deprived immunostimulated glial cells. But WKL-006 did not prevent the increased death in NMDA-induced cerebral cortical neurons. Taken together, these results indicate support that WKL-006 useful for the treatment of CNS disease such as cerebral ischemic stroke.;WKL-006 은 wogonin과 KL-1037의 유도체이다. KL-1037 은 소교세포의 과도한 염증반응을 줄이는 것으로 보고된 바 있으며, wogonin 은 플라본류의 일종으로서 한약재인 황금(黃金)으로 부터의 추출물이다. Wogonin 은 황산화 작용과 항염증작용이 있는것으로 밝혀졌으며 임상에서 아토피성 피부염, 고지방혈증과 동맥경화를 비롯하여 많은 염증성 질병에 사용되고있다. 본 연구에서는 다양한 동물실험과 세포실험 모델에서 WKL-006 이 어떠한 작용을 하는지에 대하여 실험을 진행하였다. 먼저, 국소뇌허혈 모델인 중대뇌 동맥을 결찰하는 실험에서 WKL-006 은 허혈에 의한 신경세포의 보호작용을 보였다. 이러한 세포사의 발생기전으로 free radicals, glutamate, calcium overload, NO 및 여러 cytokines 등 많은 요인들이 관여하는 것으로 알려져 있다. 이의 치료약물로는 glutamate receptor anatagonists, calcium channel antagonists, GABA neurotransmission 촉진제, NOS inhibitors, antioxidants 등의 연구되고 있어 이와 관련지어 실험을 수행하였다. 첫번째로, 신경교세포에 IFN-γ/LPS 를 이틀동안 처리하여 inflammation을 유도한후, glucose 가 없는 media로 갈아주어 ONOO^(-)로 세포사를 유도한 실험에서 WKL-006 이 신경교세포의 죽음을 막아내는 것을 확인하였다. 그러나, NMDA로 뇌 피질의 뉴런의 죽음을 유도하였을 경우에는 뉴런의 보호작용을 하지 못하였다. 두번째로 WKL-006의 항염증 테스트를 위하여 소교세포에 LPS를 처리하여 활성화된 소교세포로부터 생성되는 염증성 매자를 측정하였다. LPS로 인해 활성화된 소교세포는 염증성 매자인 NO, TNF-α, IL-1β 등의 사이토카인 및 케모카인을 형성한다. WKL-006 은 이들의 mRNA 발현과 단백질 생성에 어떠한 영향도 미치지 못하였다. 소교세포의 이동현상은 중추 신경계의 발달과 상처의 치료, 그리고 암세포의 전이 등에서 중요한 역할을 한다. 뇌에 외부적 손상이나 염증이 생겼을 경우 손상부위로 이동하여 침 염증성 사이토카인들을 분비하여서 신경세포에 독성을 유발한다. 본 실험에서 WKL-006은 MCP-1에 의한 소교세포의 이동현상을 현저하게 억제하였다. 또한, 이러한 이동현상은 신호의 이차전달자인 cAMP 가 연관되었다고 알려져 있고, 특히 cAMP를 증가시키는 물질들이 이동현상을 억제한다고 여러 세포에서 보고되어있다. 우리는 cAMP를 올리는 물질로 알려진 forskolin은 소교세포의 이동현상을 억제하였고, WKL-006 역시 cAMP 생성을 증가시켰다. 그리고, adenyl cyclase 억제제인 SQ22536 그리고 PKA 억제제인 H89를 WKL-006 과 함께 처리하여 WKL-006으로 인한 소교세포의 이동억제를 저해시킴으로써 WKL-006 은 cAMP/PKA 의존하여 소교세포의 이동을 억제한다는 것을 확인하였다. 이러한 실험결과로부터 WKL-006 은 뇌신경 보호작용을 지님으로써 뇌경색과 같은 뇌질환 치료에 WKL-006 을 사용할 수 있는 가능성을 시사한다.