배양 해마절편에서 Aβ25-35에 의한 신경세포의 손상 및 시냅스변화 연구

Abstract

알츠하이머병(Alzheimer's disease)이 발생하게 되면 시냅스의 손실이 일어나는데 이러한 시냅스 손실은 전시냅스에서 신경전달물질의 유리를 조절하는 다양한 신경소포체 막단백질들이 관여한다고 알려져 있다. 특히 알츠하이머병에서 나타나는 기억장애는 시냅스의 손상과 연관이 있다. 시냅스의 손상으로 신경돌기(neurite)에 노인성 반점(senile plaques)이 나타나고, 신경소포체와 신경소포체 막단백질 및 신경전달물질들의 변동이 일어난다. 따라서 시냅스 손상은 알츠하이머병에서 나타나는 기억장애와 인지장애의 병인기전과 관련이 있다고 생각된다. 기억과 학습을 관장하는 기관인 해마는 신경회로 복합체를 가지고 있는 부분으로써, 알츠하이머병에서는 피라밋세포층(pyramidal cell layer)과 치아이랑(dentate gyrus)의 신경세포가 많은 손상을 입는다. 본 연구에서는 해마 조직절편에 Aβ25-35를 1μM, 2.5μM, 5μM로 투여하여 cresyl violet 염색, propidium Iodide(PI) 염색, Fluoro-Jade B 염색, Annexin Ⅴ 염색으로 세포손상의 정도를 관찰하였다. 전자현미경으로는 손상된 세포의 미세구조를 관찰하였다. 또한 caspase-3, NeuN, Bcl2 면역형광 염색으로 신경세포 손상에 따르는 단백질의 변화를 보았다. Cresyl violet 염색, PI 염색 및 Fluoro-Jade B 염색의 결과, Aβ25-35의 처리농도가 높을수록 피라밋세포층과 치아이랑에 염색이 증가하였다. 초기 세포자멸사를 인지하는 Annexin Ⅴ 염색이 증가하였고, 미세구조 관찰시 세포소기관들의 세포사멸의 형태가 관찰되었다. Aβ25-35의 처리농도에 따라 NeuN의 염색은 감소하고, Bcl2와 caspase-3의 면역형광염색은 Bcl2의 활성에 따라 caspase-3의 변화가 나타났다. 알츠하이머병 및 신경퇴행과정이 시냅스 말단에서 시작된다고 보고한 바 있어 Aβ25-35에 의해 유도되는 세포사멸에서 전시냅스 단백질의 변화를 관찰하였다. 알츠하이머병에서 나타나는 전시냅스의 변화를 관찰하기 위해서 Aβ25-35를 처리한 배양해마조직절편에서 SNAP-25와 synaptophysin 단백질변동을 Western blot과 면역형광염색을 통하여 검색하였다. CA3부위와 특히 치아이랑부위에 SNAP-25과 synaptophysin의 면역형광이 Aβ25-35의 처리 농도에 따라 감소하여 Aβ25-35가 전시냅스 단백질의 손실을 일으켰다. 따라서 본 연구는 배양해마조직절편에서 Aβ25-35가 유도하는 신경세포의 손실은 시냅스의 기능 장애를 일으켜 알츠하이머병에서 나타나는 기억장애 및 인지기능 장애와 관련이 있음을 시사한다.;Neurodegenerative disorders are characterized by neuronal damage followed by synaptic injury. The memory loss of Alzheimer's disease might be related to the synaptic defects of damaged neurons in the hippocampus. The aim of this study is to Investigate the relationship between the amyloid peptide Aβ25-35 induced neuronal cell death and presynaptic dysfunction in the organotypic hippocampal slice cultures. The Aβ25-35-induced neuronal damages, measured with propidium iodide (PI) uptake, Fluoro-Jade B staining, Annexin Ⅴ labeling, dramatically increased but NeuN positive neurons are decreased in aconcentration-dependent manner. Also The ultrastructure examined in the cultured hippocampal slices by electron microscopy To determine the changes in the presynaptic marker proteins level, immunofluorescence and Western blot analysis were used. Expression of SNAP-25 and synaptophysin, the presynaptic protein, were reduced by Aβ25-35 in the stratum lucidum of CA3 subfield and the molecular layer of dentate gyrus(DG). These results suggest that Aβ25-35 induced neuronal damage and synaptic changes may be relate to the synaptic dysfunctions.