사람 제대혈에서 얻은 CD133 양성 세포의 체외 증폭 조건의 확립

Abstract

제대혈은 골수이식의 단점을 극복 할 수 있는 장점을 가지고 있어 골수이식을 대신 할 수 있으나 충분한 수의 조혈모세포를 얻는데 한계가 있어 임상에 제한적으로 이용되었다. 본 연구는 이러한 제대혈의 단점을 극복하고자 체외에서 제대혈 줄기세포를 증폭 할 수 있는 배양기법을 개발하여, 증폭 배양을 통해 총 유핵세포 및 CD34 양성 세포를 충분히 얻을 수 있는 가장 적절한 배양조건을 확립하고자 하였다. 사람의 제대혈에서 원시 조혈모세포 표지자로 알려진 CD133 양성 세포를 MACs를 이용하여 분리하였다. 체외 배양은 세 가지의 각각 다른 조건을 비교하였으며 각 조건은 TPO 100 ng/mL, SCF 100 ng/mL, FL 100 ng/mL을 사용한 조건 (이하 TSF)과 여기에 IL-3 10 ng/mL를 추가한 조건 (이하 TSF+IL-3), 또는 IL-6 10 ng/mL을 추가한 조건 (TSF+IL-6)이었다. 이러한 각 조건에서 증폭 배양 전, 후 세포의 수와 구성을 흐름세포 측정법 등으로 분석하여 각 배양 조건에 따른 증폭 능력을 비교하였으며, 세포의 집락형성능력시험 및 SCID/NOD 마우스를 이용한 생체 내 생착 능력검사를 통해 배양 후 세포의 특성 및 기능의 변화여부 및 각각의 증폭 배양조건을 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1) 각 배양조건에서 1주와 2주시의 평균 CD34 양성 세포(총 유핵세포)의 증식 배수는 1주는 각각 TSF, TSF+IL-3, 그리고 TSF+IL-6 조건에서 8.2배(10.2배), 16.3배(23.1배), 10.7배(14.5배)였고, 2주는 각각 TSF, TSF+IL-3, 그리고 TSF+IL-6 조건에서 7.1배(19.6배), 5.5배(39.3배), 그리고 6.7배(24.5배)였다. 2) 증폭 배양 전, 후의 세포의 형태학적 차이는 관찰되지 않았다. 3) 증폭 배양 후 세포의 면역학적 분석 결과 CD45, CD133와 HLA-DR 항원이 표현되었다. 4) 증폭 배양 후 CD34 양성 세포의 집락형성시험 결과는 배양 전의 CD34 양성 세포에 비해 총 집락 수는 감소하였으나, CFU-G, CFU-M, CFU-GM 및 CFU-E는 증폭 배양 전, 후에 차이를 보이지 않았다. 5) 증폭 배양 후 세포의 SCID/NOD 마우스 이식실험에서 성공적으로 골수 생착이 이루어졌다. 따라서 본 연구에서는 사람의 제대혈에서 얻은 CD133 양성 세포를 이용한 체외 증폭 실험에서 줄기세포의 능력을 유지하면서 체외 증폭이 가능했으며, 증폭 배양 조건 중 TSF+IL-3이 가장 효과적인 조건임을 알 수 있었다.;Umbilical cord blood (UCB) has been suggested as an alternative source of acquiring hematopoietic stem cells. However, in spite of several advantages of UCB transplantation over bone marrow transplantation, UCB transplantation has a limitation in that obtainable CD34+ (a marker for hematopoietic stem cells) cell dose is minimal to use. The purpose of this study was whether hematopoietic stem cells from human UCB could be expanded in number of total nucleated cells (TNC) and CD34+ cells, whether they are able to maintain their stemness in ex vivo culture system and the optimal ex vivo culture condition could be determined. We separated CD133+ cells using MACs by the manufacturer's instructions. The CD133+ cells from human UCB were cultured under three different culture conditions. The cells were added by TSF (thrombopoietin 100 ng/mL, stem cell factor 100 ng/mL, and Flt-3 ligand 100 ng/mL), TSF + IL-3 (interleukin-3 10 ng/mL) or TSF + IL-6 10 ng/mL, and they were incubated for two weeks. The number of cultured cells (TNC and CD34+ cells) was counted. The cell function was studied in vitro and in vivo by immunophenotyping, cell cycle analysis, CFU assay and SCID/NOD bone marrow transplantation. The results were as follows; 1) after a one-week culture, the average fold expansion of CD34+ cells (and TNC) in TSF, TSF + IL-3, and TSF + IL-6 were 8.2 fold (10.2 fold), 16.3 fold (23.1 fold) and 10.7 fold (14.5 fold), respectively. After a two-week culture, the average fold expansion of CD34+ cells (and TNC) in TSF, TSF + IL-3, and TSF + IL-6 were 7.1 fold (19.6 fold), 5.5 fold (39.3 fold), and 6.7 fold (24.5 fold), respectively. 2) There was no morphologic difference between before and after cell culture. 3) Imunophenotyping analysis showed that after culture, the cells were expressed CD45, CD133, and HLA-DR antigen. 4) CFU assay showed that the number of total colony was lower in cells after culture, but there was no difference in CFU-G, CFU-GM, CFU-M and CFU-E, before and after culture. 5) In bone marrow of the SCID/NOD transplanted mice cells had been successfully engrafted. In conclusion, CD133+ cells from human UCB are capable to expand with no functional changes in ex vivo expansion culture system and we found that the TSF with IL-3 culture condition was the optimal culture media.