Germline mutations of BRCA1 and BRCA2 from breast cancer patients in Korea using denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC)

Abstract

유방암은 최근에 발병이 증가되어 현재 한국에서 가장 흔한 여성암이 되었다. BRCA1 과 BRCA2 유전자의 돌연변이가 유방암과 난소암의 발병에 관여하는데, 이러한 BRCA1과 BRCA2 와 같이 크기가 큰 유전자의 돌연변이 분석은 비용과 시간이 많이 든다. 최근에 DHPLC 가 유전자의 돌연변이를 선별하는 방법으로 발달되었다. 본 연구에서는 한국인 유방암 환자의 BRCA1과 BRCA2 돌연변이를 알아보기 위해 유방암에 대한 가족력 여부와 상관없이 의뢰된 유방암 환자 793명을 분석하였으며 동시에 정상 대조군 167명을 DHPLC법을 이용하여 분석하였다. 연구결과는 다음과 같다. 1) BRCA 유전자검사에서 돌연변이 유형별로 총 79 개를 발견하였고 이들 중 34 (43%)개는 지금까지 보고가 되지 않은 돌연변이이다. 또한 정상 단백질을 짧게 만드는 의미있는(deleterious) 돌연변이인 11개의 frameshift 돌연변이와 4개의 nonsense 돌연변이(BRCA1 ; 7개, BRCA2 ; 8개)가 20명의 환자에서 발견되었다. 의미있는 돌연변이 15개중, 7개(47%)의 돌연변이(BRCA1; 1047C>T, 2167delA, 2478delG, 5616del10, BRCA2; 2487delT, 8662delGGA, 10378C>T)가 처음으로 발견되었다. 2) 환자 대상군 793명중 의미있는 돌연변이가 20명(2.5%)에서 발견되었는데recurrent 혹은 founder 돌연변이는 아니었다. BRCA2 유전자에서 3개의 돌연변이(1627A>T, 3972delTGAG, 7708C>T)가 20명중7명의 환자에서 발견되었는데 이는 한국인을 대상으로 한 다른 연구에서도 검출되었다. 3) 정상대조군 167명에서 의미있는 돌연변이는 발견되지 않았고, BRCA1에서 7개(2201T, 2430C, 2731T, 3232G, 3667G, 4427C, 4956G), BRCA2에서 9개(203A, 1093C, 1342A, 1593G, 2457C, 3199G, 3624G, 4035C, 7470G)의 돌연변이는 정상대조군에서 일배체형처럼 관찰되면서 높은 빈도로 검출되었는데 환자 대상군도 비슷한 경향과 빈도를 보였다. 4) 환자 대상군 793명 중, 의무기록검토가 가능했던 135명에 대해BRCA 유전자검사에서 의미있는 돌연변이를 갖는 환자군 20명과 갖지 않는 환자군 115명으로 나누어 임상적인 특징을 비교한 결과 진단시 나이, 가족력, 조직학적 소견 모두 두 군간에 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. BRCA관련 암조직에서 그렇지 않은 암조직에 비해 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, HER-2/neu양성은 더 낮고, p53은 더 높게 표현되는 경향성을 갖는 것으로 나타났는데 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 5) BRCA 유전자검사에서 돌연변이 선별에 사용된 DHPLC 방법의 민감도를 평가하기 위해 1,620 증폭산물 (81개 부위에 대한 20명의 검체)를 직접염기서열분석법과 이중맹검을 시행하였는데 직접염기서열분석법 결과와 모두 일치하였다. 산발적 한국인 유방암 환자 793명에서 발견된 79개의 BRCA돌연변이중에서 34 (43%)개가 이제까지 보고되지 않은 것으로서 새로운 돌연변이가 높은 비율을 차지하였다. 의미있는 돌연변이는 793명 중 20명의 환자에서 발견되어 2.5% 빈도로 관찰되었는데 이들은recurrent 혹은 founder돌연변이는 아니었다. BRCA2 유전자에서 3개의 돌연변이(1627A>T, 3972delTGAG, 7708C>T)는 한국인을 대상으로 한 다른 연구에서도 검출되었던 돌연변이로 한국인에서 recurrent 돌연변이의 가능성이 있는 것으로 추측할 수 있다. 본 연구에서 DHPLC법이 민감도가 높으면서 비용효과가 큰 돌연변이 선별검사법으로 나타났는데 산발적으로 발생하는 한국인 유방암 환자를 위한 BRCA 돌연변이 선별검사에 DHPLC법이 유용하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.;The incidence of breast cancer has been increasing recently and it becames the most common female cancer in Korea. BRCA1 and BRCA2 germline mutations increase substantial life-long risk of both breast and ovarian cancers. Mutation analysis of large genes, such as BRCA1 and BRCA2, is expensive and time-consuming procedure. Recently, denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) has been developed as a mutation pre-screening method. To investigate the presence of BRCA1 and BRCA2 mutations in sporadic breast cancer patients in Korea, the samples of 793 sporadic breast cancer patients and 167 normal controls were analyzed by DHPLC. The results are summarized as follows: 1) Out of 79 mutations identified in BRCA mutation analysis, 34 (43%) sequence alterations were novel. Fifteen deleterious mutations were detected in 20 patients: 11 frameshift mutations and 4 nonsense mutations (7 in BRCA1 and 8 in BRCA2) led to premature termination producing shortened proteins. Seven (47%) out of 15 deleterious mutations (1047C>T, 2167delA, 2478delG, and 5616del10 in BRCA1, 2487delT, 8662delGGA, and 10378C>T in BRCA2) have not been reported previously. 2) The deleterious mutations were detected in 20 out of 793 breast cancer patients (2.5%), which were not recurrent or founder mutation. Three mutations in BRCA2 (1627A>T, 3972delTGAG, 7708C>T) detected in 7 out of 20 patients were also identified in other previous studies on Korean population. 3) The deleterious mutations were not detected in 167 normal controls. Seven BRCA1 mutations (2201T, 2430C, 2731T, 3232G, 3667G, 4427C, 4956G) and nine BRCA2 mutations (203A, 1093C, 1342A, 1593G, 2457C, 3199G, 3624G, 4035C, 7470G) were shown together like a haplotype and showed high frequency in normal controls. They also showed similar tendency and frequency in 793 breast cancer patients. 4) The medical records were reviewed in 135 patients, which included 20 deleterious mutation positive and 115 negative groups. The median age at diagnosis, family history, and histologic type did not show statistically significant difference between these two groups. BRCA mutation-associated tumors showed lower ER, PR, and HER-2/neu and higher p53 expression, of which difference was not statistically significant. 5) To verify the sensitivity of DHPLC screening, 1,620 fragments (81 amplicons ´ 20 samples) were tested in a blind manner by direct DNA sequencing, which did not show discrepancies. Among 79 BRCA mutations detected in 793 sporadic breast cancer patients in Korea, 34 (43%) mutations have not been reported previously, thus many novel mutations were identified. Deleterious germline BRCA mutations were detected in 20/793 patients (2.5%), which were not recurrent or founder mutation. Three mutations in BRCA2 (1627A>T, 3972delTGAG, 7708C>T) were detected in 7 out of 20 patients, which were also identified in other previous studies for BRCA mutations on Korean population and they might be a recurrent mutation for Korean breast cancer patients. This study shows that DHPLC is a sensitive and cost-effective method for the mutation screening and suggests that it is useful tool for BRCA mutation analysis for sporadic breast cancer patients in Korea.