제대혈 CD34+세포를 이용한 erythropoietin 투여시기에 따른 체외 적혈구 생성

Abstract

체외 적혈구 생성은 thalassemia, 선천성구상적혈구증, 적혈구효소결핍증 등 적혈구에 결함이 있는 질환의 원인 규명에 이용될 뿐 아니라 수혈 공여자가 부족한 현실에서 인공 적혈구 수혈등을 가능하게 한다. 제대혈 CD34+ 세포에서 성숙된 적혈구로의 체외 증폭에 관한 연구는 분화는 억제하면서 증폭만을 유도하는 방법 개발에 초점을 맞추어 여러 연구들이 발표되어 왔다. 본 연구에서는 erythropoietin(EPO)의 역할 및 투입 시기에 따라 ex vivo에서 적혈구의 생산을 조절 할 수 있는지 알아 보고자 하였다. 정상 분만한 만삭 산모의 제대혈로부터 CD34+ 세포를 분리하여 thrombopoietin (TPO; 50 ng/mL)과 flt-3 ligand (FL; 50 ng/mL)를 첨가하여 배양하였다. 적혈구계열 세포 분화 과정 중 EPO의 의존도를 알아보기 위해 TPO+FL 사이토카인 조합에 EPO 2 U/mL를 0, 3, 6, 9, 12 및 15일째 첨가한 군으로 각각 나누어 실험을 진행하였다. 세포 성숙에 대한 형태학적인 관찰을 위해 분리된 혹은 배양된 CD34+ 세포를 cytospin 처리하여 May-Grunwald-Giemsa 및 Benzidine 염색으로 관찰하였다. 적혈구계열 세포의 증폭 및 생성을 확인하기 위해 전체 세포수에 대한 적혈구세포 표면 항원인 glycophorin A (GPA) 양성 세포의 비율 (%)을 유세포 분석기로 산정하였다. 정제된 세포의 CD34 양성율은 96.6±1.8%였다. 정제된 CD34+ 세포는 비교적 일정한 모양의 미성숙 세포이고 핵:세포질의 비율이 높으며 basophilic cytoplasm을 보였다. 실험실 내에서 생성된 적혈구계열의 세포는 일반적으로 보는 in vivo의 세포형태와 차이가 있었다. 이 세포들은 EPO 존재하에 TPO+FL의 사이토카인 조합으로 체외증폭 시켰을 때 배양 6일째는 pronormoblast 단계의 세포와 유사한 모양의 세포들이 출현하기 시작하여 9일째에는 normoblast 단계 세포들이 나타났고 배양 12일 째에는 대부분의 세포가 망상 적혈구 모양을 보여 주었다. 적혈구의 헤모글로빈 합성 여부를 benzidine 염색을 통하여 확인한 결과 증폭 6일째부터 헤모글로빈을 가지는 세포의 출현이 관찰되었으며 12일째는 정점에 달하였다가 감소하는 양상이 관찰되었다. EPO를 주기적으로 나누어 첨가한 실험에서는 EPO를 6일째 첨가한 군에서 첨가 6일 경과 후에 545배, 9일후에는 1,440 배로 세포가 증폭되었으며 18일 이상 지속되었다. 9일째 EPO를 첨가한 군은 증폭된 세포수는 많았으나 지속되는 시간이 12일로 짧아 6일째 투여한 군에서 가장 많은 양의 세포를 얻을 수 있었다. 증폭된 세포에서 GPA 발현은 EPO 투여전에는 GPA가 발현하지 않다가 EPO 투여 후에는 EPO의 투여 시점과는 관계없이 6일 후로 일관성이 있게 최고에 달하였다. 결론적으로 실험관내 적혈구 분화과정은 EPO-비의존적인 과정과 EPO-의존적인 과정으로 구분할 수 있으며, 시간적으로는 각각 6일 정도가 소요되며 TPO+FL 사이토카인 조합에 의한 증폭과정에도 EPO-비의존적인 과정은 일어나는 것으로 추정된다.; Purpose : Ex vivo red blood cell (RBC) production may prove useful in understanding the pathophysiology of RBC disorders such as thalassemia, congenital spherocytosis and RBC enzyme deficiencies. Differenciation and expansion of erythroid cells from human umbilical cord blood CD 34+ cells has been reported. In this study, we have investigated the role of erythropoietin(EPO) in RBC production by periodic adding of EPO. Materials and Methods : CD 34+ cells were purified from human cord blood and cultured in media in the presence of thrombopoietin (TPO) and flt-3 (FL) combination of cytokines with periodic adding of EPO on day 0, 3, 6, 9, 12 and 15. For morphological analysis of cell maturation, CD 34+ cells were stained with May-Grunwald-Giemsa and benzidine staining. To determine erythroid cell production and expansion the ratio of positive RBC surface antigen glycophorin A (GPA) cells to total cell count was analyzed. Results : The proportion of CD 34+ cells in the purified fractions was 96.6±1.8%. Purified CD 34+ cells were homogenous immature cells with a high nuclear-to-cytoplasm ratio and basophilic cytoplasm. RBC produced in laboratory showed morphological differences from that shown in vivo. Ex vivo expansion with TPO and FL cytokine combination, cells similar to pronormoblast appeared on day 6. On day 12, most of the cells were similar to reticulocytes. Hemoglobin synthesis was confirmed with benzidine staining. Six days after EPO was added cells with hemoglobin were observed which reached maximum at the 12th day and decreased thereafter. Cells with EPO added on day 6 of culture expanded 545 times after six days and 1,440 times after nine days and lasted for longer than 18 days. Group with EPO added on day 9 showed similar effect, but it lasted about 12 days. Therefore adding EPO on day 6 of culture was most efficient in expanding cells. Expanded cells did not express GPA initially but after adding EPO it consistantly reached maximum after six days. Conclusion : Erythroid cell differenciation can be divided into EPO-independant and EPO dependent process and it takes about 6 days for each process. EPO independent process may occur in expansion in medium with TPO+FL cytokine combination.