Ciclopirox analogue (WKD-031) Prevents Low Potassium-Induced Apoptosis in Cultured Cerebellar Granule Neurons via Inhibition of Cell Cycle and Mitochondrial Injury

Abstract

Rat cerebellar granule neurons (CGN) undergo apoptotic death, when transferred from depolarizing high potassium (25 mM)-containing medium to non-depolarizing low potassium (5 mM) condition. Here we report that a ciclopirox analogue WKD-031 markedly blocks the low potassium-induced apoptosis in cultured CGN. Cell viability was studied using the flow cytometry and Hoechst 33258 as fluorescence dye. Neuronal apoptosis was accompanied by changes in cell cycle regulatory protein expression. Cyclin D1, a major regulatory protein of G1/S transition in cell cycle, increased early during apoptosis. WKD-031 completely prevented the augmentation of cyclin D1 after potassium deprivation. On the other hand, expression of cyclin E, cyclin-dependent kinase 2 (cdk2) and cdk4 remained constant. WKD-031 was further found to block the induction of retinoblastoma protein (Rb) phosphorylation that is a major event occurring after cdk activation at the G1/S phase of the cell cycle. Mitochondria are pivotal in low potassium-induced apoptotic events in CGN. WKD-031 prevented the mitochondrial transmembrane potential depolarization in CGN maintained in low potassium. The data suggest that the neuroprotective effect of WKD-031 may be in part due to the inhibition of cell cycle progression and/or blockade of mitochondrial dysfunction induced by low potassium in CGN.; 뇌 내의 소뇌과립세포 (cerebellar granule cells)와 같은 신경세포는 이미 분화가 끝나 더 이상 세포주기가 돌지 않는 세포이다. 그러나 손상을 받게 되면 비정상적으로 세포주기가 돌아가게 되면서 세포사멸을 초래한다. 기존의 알려진 바에 의하면, 이들의 세포자멸사 (apoptosis)에서 cyclin D1과 retinoblastoma (Rb) 단백질이 과발현되며, 이는 G1/S 변환 차단제나 cyclin dependent kinase inhibitor (cdki)에 의해서 억제된다고 알려져 있다. 본 연구에서는 소뇌과립세포에서 유도되어진 세포사에 어떠한 cell cycle regulatory proteins이 관여하며, 또 이러한 현상이 정확하게 어떤 매카니즘을 통하여 일어나는지를 규명하고자 하였다. 본 실험을 통하여 저하된 칼륨에 의해 유도된 세포사멸은 ciclopirox의 유사체인 WKD-031에 의해 완벽하게 억제됨을 확인하였다. WKD-031은 세포주기 진행을 억제하는데, 특히 세포주기를 조절하는 단백질 중 cyclin D1과 cyclin E의 과발현을 방지하고, 그 하부에 존재하는 Rb단백질의 인산화를 감소시켰다. 또한 미토콘드리아의 막전위의 탈분극을 억제하였으며, 저칼륨에 의해 유도된 ERK와 JNK (MAPK family)의 activity는 WKD-031에 의해 역전되었다. 그러나Cdki인 roscovitine이 pJNK의 과발현을 억제하지 못하였음에도 불구하고 세포의 사멸이 감소되는 것으로 보아, 저칼륨에 의한 소뇌과립세포 사멸기전에 MAPK활성은 관련되어 있지 않을 가능성이 높음을 시사하고 있다. 이러한 연구결과에서 신약 WKD-031은 세포주기의 억제와 미토콘드리아의 기능의 보호효과 등을 통하여 뇌졸증과 같은 퇴행성 신경질환에 유용할 것이다.