기관형적 해마 절편 배양에서 NMDA로 유발한 신경세포손상에 대한 비타민 D의 효과: 신경성장인자를 통한 신경세포 보호

Abstract

The organotypic hippocampal slices offer the benefits of maintaining not only the morphology of neuron surrounded by glial cells, but also the synaptic connection. The hippocampal slices prepared from young rodents can be cultured for many weeks or months, and are frequently used as important tools for studying the physiological and pharmacological properties of neuronal circuits. Vitamin D has recently been shown to have neuroprotective effect in cultured hippocampal neurons and neural tissues in vivo. We previously observed that vitamin D3 had neuroprotective effect via NGF in the experiment using the mouse hippocampal slice culture We wanted to observe the neuroprotective effect of vitamin D3 against NMDA-induced excitotoxicity in organotypic hippocampal slice cultures and to evaluate its mechanism of action. Explant culture of the hippocampus was derived from 6 day-old rat pups and used at 14 days in vitro. We have applied for 1 hour a low concentration of NMDA(10 μM), a glutamate receptor subtype agonist, at concentrations of vitamin D3 between 1 nM and 1000 nM. Neuronal damage was assessed serially by the intensity of fluorescence of nuclei in the damaged neurons permeable to propidium iodide uptake. We have demonstrated a protective effect by vitamin D3 at concentrations between 1 nM and 1000 nM. We also found that when TrkA blocking antibody was applied, it reversed the protective effect of vitamin D3 against NMDA neurotoxicity. These results suggest that vitamin D has neuroprotective effect and its effect is being mediated through NGF pathway.;기관형적 배양(organotypic culture)은 생후 6-8일 된 어린 쥐의 해마조직을 체외 배양하여 신경 세포들의 형태뿐만 아니라 연접부 연결을 그대로 유지할 수 있는 방법으로 신경 세포들이 계속 분화 하면서 생체 정상부위(in situ)에서 관찰되는 것과 매우 흡사한 표현 형태와 외형을 갖춘 조직 기관화가 이루어지기 때문에 장기간의 생존이 요구되는 실험, 예를 들어 약제나 독성물질의 장기간 효과를 보는 실험에 많이 이용되고 있다 (Gahwiler et al. 1997; Noraberg et al.1999). 비타민 D의 활동성 대사물인 1α,25(OH)₂vitamin D₃[1α,25(OH)₂D₃, 이하 비타민 D3]의 중추 신경계에서의 역할은 최근에 밝혀지기 시작했다. 비타민 D3는 미세아교세포에서 생성되고 (Neveu et al. 1994) 비타민 D 수용체 (VDR)는 대뇌피질, 변연계, 간뇌, 소뇌, 뇌교 주변, 척수 등에 광범위하게 발현되며 (Prufer et al. 1999), 미세아교세포에서 신경 영양 인자들(neurotrophins)과 글루타치온(glutathione)을 증가시킨다 (Neveu et al. 1994; Garcion et al. 1999). 최근 신경 세포를 이용한 실험에서 Vitamin D3가 신경영양인자의 발현을 촉진함으로써 신경세포 독성에 대한 보호 작용을 한다는 여러 보고들이 있었다 (Jiang et al. 2003; Kaleuff et al. 2004). 생쥐의 기관형적 해마조직을 혈청배제배양액 (serum free media)에서 배양할 경우 신경세포의 apoptosis가 서서히 일어나는데, 비타민 D3를 처치하면 신경세포의 사멸이 줄어들고, 신경 성장 인자 (Nerve growth factor, NGF)의 발현이 증가함을 관찰 하였다. 따라서 본 연구에서는 NMDA로 유발된 신경세포 손상에 대해 비타민 D3가 신경보호 작용을 할 것이라는 가설 하에 체외 배양된 흰 쥐의 해마조직에 NMDA를 이용하여 신경세포 손상이 일어나는 것을 확인하고, 비타민 D3를 전처치하여 신경세포 손상이 감소하는 것을 확인하였다. 신경 보호 작용의 기전으로 NGF가 작용함을 알아보기 위하여 비타민 D3가 포함된 배지에 NGF의 수용체 중 하나인 tyrosin kinase A (TrkA)에 대한 항-TrkA 차단 항체 [anti-TrkA blocking antibody (1:400)]를 처치하여 배양한 후 비타민 D3 의 신경세포 보호 효과가 소실되는 것을 관찰하였다. 그러므로 비타민 D3가 NMDA에 의한 세포독성에 대해 신경보호 효과가 있고, 그 기전 중 하나는 신경영양인자들 중에서 NGF가 TrkA에 작용하여 이루어지며, 이러한 결과는 신경계의 퇴행성 질환의 새로운 치료전략으로서 지속적 연구 가치가 있을 것으로 생각된다.