다제 내성 Pseudomonas aeruginosa와 Acinetobacter baumannii 균주의metallo-beta-lactamase 및 PER-1 ESBL 생성과 항균제 병합 효과

Abstract

Pseudomonas aeruginosa와 Acinetobacter baumannii는 병원 감염의 주요 원인균이며 최근 4세대 cephalosporin과 carbapenem 계열까지 내성인 다제 내성 균주가 출현하고 있다. 본 연구에서는 분자 역학적 방법을 통하여 다제 내성 P. aeruginosa와 A. baumannii 균주의 항균제 내성 기전과 균주들 간의 유전적 연관성을 규명하고자 하였다. 또한 항균제 병합 효과를 통해 다제 내성균 감염의 치료를 위한 항균제를 알아보고자 하였다. 2001년 6월부터 2004년 2월까지 이화여자대학교 의과대학 부속 목동병원진단검사의학과에 의뢰된 검체 중 imipenem을 포함한 12가지 이상의 항균제에 내성을 나타내는 다제 내성 P. aeruginosa 80균주와 A. baumannii 29균주를 대상으로 하여 metallo-beta-lactamase 생성 균주를 관찰하고, 중합효소연쇄반응과 염기서열 분석으로 유전자형을 분석하였다. Extended spectrum beta-lactamase (ESBL) 생성 균주를 관찰하고, 중합효소연쇄반응 과 염기서열 분석을 시행하여 유전자형을 확인하였다. Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)와 UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic average) 분석을 통하여 균주들 간의 유전적 연관성을 관찰하였다. P. aeruginosa 균주는 checkerboard 법을 통하여 항균제의 병합 효과를 분석하였다. 연구 결과는 다음과 같다. 1) 항균제 감수성 검사 결과 대부분의 균주가 12가지 이상의 항균제에 내성을 나타냈다. P. aeruginosa와 A. baumannii 균주에서 colistin에 내성을 나타낸 균주는 없었다. 최소억제농도 측정결과 P. aeruginosa와 A. baumannii 균주는 대부분의 항균제에 고도내성을 나타냈으며, 최종 항균제로 사용되는 ceftazidime, cefepime, meropenem에도 MIC90은 각각 128, 512, 64 μg/mL로 고도내성을 나타냈다. colistin은 MIC50 1 μg/mL, MIC90 2 μg/mL로 모두 감수성이었다. 2) P. aeruginosa 균주의 항균제 병합 효과 검사에서 상승 작용을 나타낸 균주는 관찰되지 않았으나, 부분상승작용을 나타낸 균주는 관찰되었고, ceftazidime과 amikacin을 병합하였을 때 20균주 중 8균주(40%)에서, ceftazidime과 gentamicin을 병합하였을 때 13균주(65%)에서, cefepime과 amikacin을 병합하였을 때 9균주(45%)에서, cefepime과 gentamicin을 병합하였을 때 15균주(75%)에서 부분상승작용을 나타냈다. 나머지는 항균제 병합효과가 무관하였고 길항작용을 나타낸 균주는 없었다. 3) P. aeruginosa 80균주 중 2균주(2.4%)에서 metallo-beta-lactamase가 검출되었다. metallo-beta-lactamase가 검출된 2균주에서 중합효소연쇄반응을 통해 blaVIM-2 유전자를 확인하였고, 염기서열 분석을 통해 유전자 구조를 확인하였을 때 blaVIM-2와 일치하였다. A. baumannii는 metallo-beta- lactamase를 생성하는 균주가 없었다. 4) P. aeruginosa는 ESBL 생성 균주가 관찰되지 않았다. A. baumannii는 29균주중 23균주(79.3%)가 ESBL 생성 균주였고, 중합효소연쇄반응에서 29균주중 27균주(93.1%)에서 blaPER-1 유전자를 나타냈다. 이는 염기서열 분석을 통한 유전자 구조와 일치하였다. 5) P. aeruginosa의 PFGE 결과는 A군부터 H군까지 8군이었으며, C군이 12균주로, C군은 소규모의 집단발생으로 생각되며, 나머지는 대부분 유전적으로 다르게 나타나서 수평 전이로 생각된다. A. baumannii는 I군부터 L군까지 4군이었으며, I군은 8균주, K군은 14균주로, 분자역학적으로 대부분 I와 K 두개의 군으로 나타나서 클론성 전이에 의한 것으로 생각된다. P. aeruginosa 균주에서 blaVIM-2 metallo-beta-lactamase에 의한 carbapenem 내성 기전을 규명하였고, A. baumannii 균주에서 blaPER-1 ESBL이 주요 내성 기전임을 확인하였다. 다제내성 P. aeruginosa 감염에서는 colistin 단독요법 또는 ceftazidime과 amikacin이나 gentamicin, cefepime과 amikacin이나 gentamicin 병합요법을 시도해 볼 수 있을 것이다.;Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii are significant pathogenic bacteria, frequently causing nosocomial infection. Recently, there have been reports of infections by multidrug-resistant P. aeruginosa or A. baumannii which are resistant to 4th generation cephalosporins such as cefepime or carbapenems such as imipenem and meropenem. The purpose of this study was to investigate the presence of metallo-beta-lactamase and the clonal relation of strains in multidrug-resistanat P. aeruginosa and A. baumannii isolates, and determine the combined effects of antibiotics in multidrug-resistant P. aeruginosa. Eighty isolates of multidrug-resistant P. aerugnosa and 29 isolates of A. baumannii were collected from specimens transported to the microbiology laboratory of Ewha Womans University Mokdong Hospital. The metallo-beta-lactamase production was tested by the modified Hodge test and the imipenem-EDTA disk synergy test. The molecular characteristics of metallo-beta-lactamase were confirmed by the polymerase chain reaction (PCR) and sequencing of blaIMP-1, blaVIM-1 and blaVIM-2 genes. The ESBL-producing strains were detected by the cefepime double disk synergy test, and the molecular characteristics were confirmed by PCR and sequencing of blaPER-1 and blaPER-2 genes. The clonal relation of the strains was determined by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) with UPGMA analysis. The combined antimicrobial effects were assessed by checkerboard method. The results were summarized as follows: 1) Most of the isolates revealed resistance to more than 12 antimicrobial drugs by the antimicrobial susceptibility test. However, no isolates of P. aeruginosa or A. baumannii revealed resistance to colistin. Most of the strains showed high level resistance to most antimicrobial agents including ceftazidime, cefepime and meropenem, with the MIC90 of 128, 512 and 64 μg/mL, respectively. The MIC50 and MIC90 of colistin were 1 μg/mL and 2 μg/mL, respectively, both of which were within the susceptible ranges. 2) The checkerboard method did not detect complete synergistic effect in any antimicrobial combinations. However, partial synergy was observed; in each combination with 40% of ceftazidime and amikacin, 65% of ceftazidime and gentamicin, 45% of cefepime and amikacin, and 75% of cefepime and gentamicin. Rest of the strains exhibited indifference, and the antagonism was not detected. 3) Two (2.4%) of 80 P. aeruginosa isolates produced metallo-beta-lactamase confirmed by the modified Hodge test and the imipenem-EDTA disk synergy test. The two metallo-beta-lactamase producing strains were confirmed by PCR and sequencing of blaVIM-2 genes. No metallo-beta-lactamases were detected in A. baumannii isolates. 4) ESBL-producing strain was not detected in any P. aeruginosa isolates. Twenty three (79.3%) of 29 A. baumannii isolates producing ESBL were confirmed by the cefepime double disk synergy test. The blaPER-1 genes were detected in 27 (93.1%) of 29 A. baumannii isolates by PCR followed by sequencing. 5) The PFGE demonstrated 8 groups (A to H) of P. aeruginosa strains including group C with 12 isolates, and 4 groups of A. baumannii including group I with 8 isolates and K with 14 isolates. In conclusion, we have confirmed that the carbapenem-resistant infection is caused by VIM-2 metallo-β-lactamase in multidrug-resistant P. aeruginosa and cefepime-resistant infection by PER-1 ESBL in multidrug-resistant A. baumannii. The P. aeruginosa strains revealed polyclonal genotypes except the group C, suggesting that P. aeruginosa infection occurs due to the horizontal transfer. In contrast, most of A. baumannii strains were divided into two groups, which implies the clonal spread. A single agent regimen of colistin or combinational regimens of ceftazidime with amikacin or gentamicin and cefepime with amikacin or gentamicin may be tried for the treatment of multidrug-resistant P. aeruginosa infections.