Effects of sphingosine 1-phosphate on cell growth, melanogenesis, and apoptosis in B16 mouse melanoma cells

Abstract

The bioactive sphingolipid metabolite sphingosine 1-phosphate (S1P) is an important lipid mediator that has novel dual actions both inside and outside of cells in dependence on the cell type. S1P is the ligand for a family of five G protein-coupled receptors (GPCRs), the Edg (endothelial differentiation gene) receptors, which includes Edg-1, 3, 5, 6, and 8. Activation of these GPCRs by S1P regulates diverse processes including cell migration, angiogenesis, vascular maturation, heart development, and neurite retraction. In neuronal cells, S1P often exerts a neuroprotective or proliferative effects. However, prolonged exposure of hippocampal neurons to S1P resulted in apoptosis. In melanoma cells, originated from neural crest, S1P enhances dendrite retraction and inhibits cell motility via Edg receptors. However, effects of S1P on the cell growth and survival of melanoma cells have not yet been investigated. The purpose of this study was to investigate effects of S1P on cell growth, melanogenesis, and apoptosis of cultured B16 mouse melanoma cells. To investigate the effect of S1P on cell growth, we performed cell proliferation assay and MTT dye-reduction assay. To observe the effect on melanogenesis, we performed melanin assay. For the identification of the expression of Edg receptors in B16 melanoma cells, we performed immunocytochemistry and western blot analysis with specific antibodies against Edg-1, 3, and 5. For the evaluation of apoptosis of cells, we used TUNEL assay and western blot analysis with specific antibodies against cleaved caspase-3. The results were summarized as follows: 1. Receptors of sphingosine 1-phosphate (EDG1/S1P₁, EDG5/S1P₂, EDG3/S1P₃) were well expressed in B16 melanoma cells. 2. S1P showed antiproliferative effect on B16 melanoma cells at 10 μM (p < 0.05). 3. S1P showed little effect on melanogenesis in B16 melanoma cells (p > 0.05). 4. The percentage of apoptotic cells after 24 h of treatment with 10 μM of S1P was significantly increased compared with control group (p < 0.001). 10 μM of S1P caused time dependent activation of caspase-3 with western blot analysis,. 5. Dihydro-S1P slightly increased B16 melanoma cell viability but did not affect significantly with MTT dye-reduction assay (p > 0.05). Pertussis toxin (PTX) did not block the apoptotic effect of S1P on B16 melanoma cells (p > 0.05). 6. The specific ERK inhibitor UO126 enhanced death of B16 melanoma cells induced by S1P (p < 0.05). In conclusion, S1P showed antiproliferative effect but little effect on melanogenesis in B16 mouse melanoma cells. This growth inhibitory effect of S1P on B16 melanoma cells was due to apoptosis via caspase-3 activation. S1P induced apoptosis of B16 melanoma cells via Edg receptors-independent, pertussis toxin-insensitive pathway and simultaneously stimulated an antiapoptotic pathway via ERK activation.;Sphingosine 1-phosphate (S1P) 는 생물활성의 지질 대사물로서 세포의 종류에 따라 세포내 또는 세포 외부에서 작용하는 중요한 지질 신호전달체이다. S1P 는 5개로 이루어진 G 단백 연결 수용체인 Edg (endothelial differentiation gene) 수용체 (Edg-1, 3, 5, 6, 8) 에 결합하여 세포의 이동, 혈관 생성, 혈관의 성숙, 심장의 발달, 및 신경세포의 돌기수축을 일으킨다고 알려졌다. 신경세포에서 S1P 의 작용은 신경보호 또는 세포의 증식을 일으킨다고 알려졌으나, 히포캄팔 신경원 세포를 S1P 에 장시간 노출시키면 세포사멸이 유도되었다. 신경세포 기원인 흑색종 세포에서는 S1P 가 Edg 수용체를 통해 돌기를 수축시키고 세포 이동성을 저해한다고 알려졌으나 아직까지 S1P 가 흑색종 세포의 성장 및 생존에 미치는 영향에 대해서는 연구되어지지 않았다. 본 연구는 B16 쥐 흑색종 세포를 배양하여 S1P 가 세포의 성장 및 멜라닌 생성, 및 세포사멸에 미치는 효과를 알아보고자 하였다. 세포 증식 실험 및 MTT dye-reduction 실험으로 S1P 가 세포 성장에 미치는 효과를 보았고, 멜라닌 양을 측정하여 멜라닌 생성에 미치는 효과를 알아보았다. B16 흑색종 세포에 S1P 의 세포질 수용체 (EDG-1, 3, 5) 가 존재하는 지 확인하기 위해 면역 세포 화학 염색 및 Edg 수용체 (Edg-1, 3, 5) 각각에 대한 특이 항체를 사용하여 western blot analysis 를 시행하였다. S1P 가 세포사멸에 미치는 영향을 알아보기 위해 TUNEL 염색법 및 caspase-3 에 대한 western blot analysisis 를 시행하였다. 결과는 다음과 같다. 1. B16 흑색종 세포에서 S1P 의 세포질 수용체 (EDG1/S1P₁, EDG5/S1P₂, EDG3/S1P₃) 가 잘 발현되었다. 2. 10 μM 의 농도의 S1P 는 통계적으로 유의하게 B16 흑색종 세포의 증식을 억제하였다 (p < 0.05). 3. S1P 는 B16 흑색종 세포의 멜라닌 합성에는 큰 영향을 미치지 않았다 (p > 0.05). 4. TUNEL 염색에서 10 μM S1P 를 처리한 군은 대조군에 비해 24시간 후 세포 사멸의 수가 통계적으로 유의하게 증가하였고 (p < 0.001), Western blot analysis 에서 10 μM S1P 는 시간에 따라 caspase-3 를 활성화 시켰다. 5. MTT-dye reduction 실험에서 dihydro-S1P 는 B16 흑색종 세포의 생존을 증가시키는 경향을 보였으나 통계적으로 유의하지 않았고 (p > 0.05), pertussis toxin 은 S1P 가 유도한 B16 흑색종 세포의 사멸을 억제하지 않았다 (p > 0.05). 6. ERK 특이 억제제인 UO126 를 처리하였을 때 S1P 에 의해 유도된 B16 흑색종 세포의 죽음이 더 심화되었다 (p < 0.05). 결론으로, S1P 는 B16 쥐 흑색종 세포의 증식을 억제하였으나 멜라닌 생성에는 큰 영향을 미치지 않았다. 이러한 S1P 의 B16 흑색종 세포 성장 억제 작용은 caspase-3 의 활성화를 통한 세포사멸의 결과로 나타났다. S1P 는 세포질 수용체를 통하지 않고 pertussis toxin 에 의해 억제되지 않는 기전으로 B16 흑색종 세포의 세포사멸을 유도함과 동시에 ERK를 활성화시켜서 세포사멸을 억제하는 작용이 있었다.