Biotic and Abiotic Factors Affecting Biofilm Formation in Pathogenic Escherichia coli O157:H7

Abstract

A biofilm is a three-dimensional structure of bacterial cells embedded in self-produced extracellular polymeric substance (EPS) such as alginate, cellulose, curli, DNA and protein. Most bacteria exist as biofilm forms in natural environment. Due to EPS, cells in the biofilm can be resistant to adverse environmental factors such as starvation, shear stress, antibiotics, etc. However, bacterial biofilm can be harmful to other living organism, especially to human. Biofilm causes a wide variety of microbial infections in the body and damages in the industry. Biofilm formation is greatly influenced by nutrient availability, quorum-sensing (QS), hydrodynamic condition, and properties of surface (hydrophobicity, electrochemical properties and structures). Microtiter plate and glass wools are commonly used for biofilm research in batch culture. However, it was recently reported that hydrodynamic condition strongly influences biofilm formation and its structure. Consequently, many researchers developed diverse methodologies for biofilm monitoring and studied about the effect of hydrodynamic conditions on biofilm to understand and regulate the mechanical properties of biofilm. Among them, the capillary tube system is widely used for morphological investigation of biofilm under controlled fluidic condition with confocal laser scanning microscope (CLSM). However, the capillary tube system has limit on difficulties of high-resolution investigation for study of nanoscale structures and isolation of RNA and proteins from biofilms, because biofilm is fixed inside tubes. Therefore, the main purpose of my thesis is to describe the effects of biotic and abiotic factors that regulate biofilm formation using diverse microscopes. To accomplish this goal, a microfluidic platform containing glass beads was developed, which made possible the micro- and nano-scales investigation of biofilms formed under fluidic condition. Additionally, the device allowed easy extraction of RNA from the biofilms for the analysis of global gene expression pattern of biofilm formed under fluidic conditions. To demonstrate the device, pathogenic Escherichia coli O157:H7 was used for biofilm research in my thesis. Through this study, it was found that abiotic and biotic factors can influence each other either positively or negatively on biofilm formation of E. coli O157:H7. In chapter I, previous literatures were reviewed about biofilm, pathogenic E. coli, and microfluidic device. In chapter II, structural differences of biofilms formed under diverse flow rates (0, 0.5, 5, and 50 µL/min) were observed on micro- and nano-scales using fluorescent microscope, scanning electron microscope (SEM), and atomic force microscope (AFM). Images of fluorescent microscope showed that the biofilms formed under the microfluidic condition were thicker and denser than those in the static condition. SEM showed nanopores (14-100 nm) in biofilm at lower flow rates (0.5 and 5 μL/min) only at within 3 days, while such small pores were not observed at higher flow rates (50 μL/min) during the entire culture period (0-5 days). These results showed that bacteria responded to slight change of environmental factors including flow rate and thus altered their architecture of biofilms to adapt their environmental stresses such as flow rate. In addition, the device allows the use of a high-resolution with nanoscale and three-dimensional imaging model which offers the potentiality to improve our visualization and understanding of the complex dynamics within biofilms. In chapter III, the effects of flow speed on QS-stimulated biofilm formation in Escherichia coli O157:H7 were investigated. For this experiment, QS mutant strains (ΔluxS and ΔlsrK mutants) were constructed and incubate inside a very thin microchannel (3 cm × 1 cm × 40 μm) with diverse flow rate (0, 1, 10 µL/min). The results showed that at a flow rate of 1 µL/min the wild-type strain formed rounded biofilms, whereas such biofilms formed by the QS mutants were fewer and thinner after 4 and 6 days. In contrast to 1 µL/min, wild type and the QS mutants formed similar biofilms at 10 µL/min of flow rate. These result showed that QS is essential in the biofilm maturation under static or very slow laminar flow conditions where the biofilm signal can be easily accumulated and transported to the sessile cells. In chapter IV, pattern of global gene expression in biofilm was investigated using DNA microarray analysis. For the analysis, biofilms were incubated in microfluidic device filled with glass beads for 4 days. The results of microarray analysis showed that the expression of yodA and ykgM genes putatively related to zinc homeostasis greatly increased in the biofilms. The ΔyodA and ΔykgM mutants produced 30% less curli and formed less biofilm under fluidic condition than their parental strain. These results indicated that YkgM and YodA proteins play positive roles in biofilm formation through regulation of Zn(II) homeostasis. These results suggest that biofilms of E. coli O157:H7 are greatly affected by the abiotic factors (flow rate, zinc availability, etc) as well as the biotic factors (zinc transporter, signal molecules, etc). Our exact understanding about these factors would provide fundamental information for developing intervention strategies to reduce the bacterial infections through the consumption of food contaminated with E. coli O157:H7. ;생물막(biofilm)이란, alginate, cellulose, curli, DNA 등 세포 외부로 분비하는 다양한 물질들에 의해 둘러 쌓여진 3차원 구조를 가진 미생물 집합체를 지칭한다. 일반적인 자연상태에서 존재하는 대부분의 미생물들은 생물막 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다. 이러한 생물막이 사회에서 문제가 되는 이유는 생물막 형태로 존재하는 미생물들은 영양소 부족 상태, 탈수, 소독제, 항생제 등 다양한 환경 스트레스에 대해 강한 저항성을 가지기 때문이다. 기존 실험결과에 따르면, 생물막 내부의 미생물들은 자유롭게 움직이고 있는 미생물(free-floating cells)에 비하여 100-1,000배 이상의 저항성을 가지는 경우도 보고된바 있다. 이러한 강한 내성 능력 때문에 생물막은 제거가 쉽지 않아 감염 이후 치료가 쉽지 않고, 또한 2차 감염을 유도하여 감염률을 증가시킨다. 이러한 생물막 형성 및 발달 과정에는 정족수 인식 기작(quorum-sensing), 영양소의 조성 및 이용가능성, 유속, 전단응력 등 다양한 요인들이 영향을 미친다는 것이 알려져 있다. 생물막에 영향을 미치는 다양한 요인들을 연구하는 기존 방법으로는 microtiter plate를 이용하거나, 유리섬유를 이용한 정치 배양 방법이 많이 사용되고 있었다. 그러나 최근에 유체의 흐름이 있는 환경에서 형성된 생물막은 정치 배양에서 형성된 생물막과는 크기, 성질, 스트레스에 대한 내성 및 구조 등에 큰 차이를 보이는 것이 보고되었다. 그래서 최근에는 유체의 흐름이 있는 조건에서 형성된 생물막의 특성을 연구하기 위하여 모세관(capillary tube)을 이용한 연구가 많이 진행되고 있다. 이러한 연구방법은 유체의 흐름이 있는 조건 하에서 형성된 생물막의 3차원 구조를 실시간으로 현미경을 사용하여 관찰하고 정량화 할 수 있다는 장점은 있다. 그러나 모세관 내부에 생물막이 형성되기 때문에, 고해상도로 관찰할 수 있는 원자 현미경(atomic force microscope)과 전자 현미경(scanning electron microscope) 등을 이용한 관찰이나, RNA 또는 단백질을 분리하여 생물막 내부에서의 전체적인 유전자 발현을 비교하는 실험에 이용하기는 쉽지 않다. 따라서 본 연구에서는 유체의 흐름이 있는 조건에서 형성된 생물막의 3차원 구조를 실시간으로 관찰 가능하며, 또한 고해상도 현미경을 이용한 관찰 및 형성된 생물막의 RNA를 추출하기 쉽도록 유리구슬을 채워 넣은 미세유체소자를 개발하였다. 그리고 본 소자의 유효성을 증명하기 위하여 병원성 대장균 O157:H7 균주를 이용하여 다양한 요인들이 이 균주의 생물막 형성 및 구조에 어떤 영향을 미치는 지에 대해 연구하였다. 1장에서는 생물막, 병원성 대장균과 미세유체소자에 대해 이미 기존에 연구되어 있는 내용에 대해 정리하였다. 2장에서는 미세유체소자를 이용하여 다양한 유속(0, 0.5, 5, 50 µL/min) 하에서 형성된 생물막의 구조의 차이를 다양한 현미경을 사용하여 마이크로와 나노 단위로 관찰하였다. 실험 결과 유속에 따라 형성되는 생물막의 양이 달라진다는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 0.5와 5 µL/min의 유속 하에서 형성된 생물막은 14~100 nm의 직경을 가지는 나노 크기의 구멍을 표면에 가지고 있는 것이 관찰되었으나, 정치 배양이나 5 µL/min의 유속 하에서 형성된 생물막에서는 유사한 구조가 관찰되지 않는다는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 실험 결과들을 통하여 유속의 차이가 대장균 O157:H7의 생물막 형성능이나 구조에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다. 3장에서는 대장균 O157:H7의 생물막 형성에 영향을 미친다고 잘 알려져 있는 정족수 인식 기작이 유체의 흐름이 있는 조건 하에서도 영향을 미칠 수 있는지를 확인하는 실험을 진행하였다. 본 실험에서는 정족수 인식 기작을 조절하는 신호전달물질을 생산하거나 조절하는 luxS와 lsrK 유전자의 돌연변이 균주들을 제작하여, 각각의 돌연변이 균주들이 다양한 유속(0, 1, 10 µL/min) 하에서 생물막을 형성하는지를 확인하였다. 실험 결과, 정치배양 상태와 상대적으로 낮은 1 µL/min 유속 하에서는 돌연변이 균주들 모두 생물막 형성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 10 µL/min의 유속 하에서는 돌연변이 균주들 모두 원균주와 유사한 생물막을 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과들을 통하여 정족수 인식 기작은 정치 배양이나 유속이 매우 낮은 조건에서만 생물막 형성에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다. 마지막으로 4장에서는 미세유체소자 안에서 유체의 흐름이 존재하는 환경에서 형성된 생물막 내부의 세포와 생물막을 형성하지 않은 자유롭게 움직이고 있는 세포의 유전자 발현 패턴의 차이를 DNA microarray analysis를 이용하여 연구하였다. 분석 결과 생물막 내부에서 아연의 흡수를 조절하는 조절인자(zinc uptake regulator, Zur)에 의해 조절되는 것으로 알려져 있는 ykgM과 yodA 유전자의 발현이 20배 이상 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 실험에서는 이 유전자들의 돌연변이 균주들을 제작하여 이 유전자들이 대장균 O157:H7 내부의 아연 농도를 유지하는데 중요하여, 아연 농도를 통하여 생물막 형성에 중요한 역할을 한다는 것을 확인할 수 있었다. 이 논문에서는 위의 실험결과들을 통하여 병원성 대장균 O157:H7의 생물막 형성 및 구조에는 유속, 정족수 인식 기작, 아연 등과 같은 다양한 요인들이 영향을 미친다는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 이러한 병원성 미생물의 생물막 형성에 영향을 미치는 다양한 요인들에 대한 연구는 최종적으로 생물막 형성을 억제하여 미생물들에 의한 감염을 줄이는데 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다.