Tylosin 생합성 유전자의 이종 발현을 통한 새로운 mycinose 생합성 경로 규명

Abstract

Tylosin, produced from Streptomyces fradiae, is a macrolide antibiotics composed of a branched lactone ring, tylactone and three deoxysugars, mycinose, mycaminose and mycarose. Of these different deoxysugars, mycinose is attached to C-23 position of tylactone. In order to identify the mycinose biosynthetic pathway, several sets of genes were heterolously expressed in an engineered strain of Streptomyces venezuelae YJ028 bearing a deletion of native pikromycin polyketide synthase and desosamine gene cluster. A plasmid harboring TDP-deoxyallose biosynthetic gene set (tylD-tylJ-tylN-desIII-desIV) was constructed and introduced into the S. venezuelae YJ028. The resulting strain produced deoxyallosyl-OMT and deoxyallosyl-DMT from 5-O-mycaminosyl tylonolide (OMT) and demycinosyl tylosin (DMT), respectively. Furthermore, expression of TDP-deoxyallose biosynthetic genes plus three different sets of methyltransferase genes tylE and tylF (tylE, tylF and tylE-tylF) in the S. venezuelae YJ028 supplemented with OMT and DMT, led to the production of 2'''-or/and 3'''-methyldeoxylallosyl OMT and 2'''-or/and 3'''-methyldeoxylallosyl DMT, respectively. These results enabled us to describe more precise mycinose biosynthetic pathway of S. fradiae and reveal the biosynthetic routes to tylosin.;본 연구는 방선균 Streptomyces fradiae에서 생산되는 tylosin을 Streptomyces venezuelae를 이종숙주로 사용하여 tylosin 유도체를 생산하고 tylosin의 생합성에 관여하는 유전자들의 기능을 파악하며, 이를 통해 mycinose의 생합성 경로를 밝히고자 하였다. Tylosin은 광범위한 동물의 호흡기 질병의 예방과 치료에 사용될 수 있는 폴리케타이드 (polyketide) 계열 항생제로서 tylactone과 3개의 deoxysugar (mycinose, mycaminose, mycarose) 를 가지는 항생 물질이다. 본 연구에서 사용된 균주인 S. venezuelae는 다른 방선균들과 비교하여 2배 이상 빠른 성장속도를 가지며 유전자 조작이 매우 용이하므로 조합 생합성의 이종 숙주로서 개발할 가치가 매우 높다. 본 연구의 방법은 메틸전이효소에 의한 tylosin 유도체를 생산하기 위해 S. venezuelae의 pikromycin polyketide (pik PKS)와 desosamine (des) 유전자 집단이 삭제된 균주인 YJ028에 deoxyallose 당의 합성에 관여하는 유전자들 (desIII, desIV, tylJ, tylD, tylN)과 메틸화에 관여하는 유전자들 (tylE, tylF)이 포함된 돌연변이주를 제작하고, 이에 OMT (5-O-mycaminosyl tylonolide)를 첨가하여 6-deoxyalloyl OMT, 2’’’-methyl deoxyallosyl OMT, 3’’’-deoxyallosyl OMT, mycinosyl OMT의 생산을 확인하였다. 그리고 메틸전이효소 (tylE, tylF, tylE.F)만이 포함된 돌연변이주를 제작하고 이의 세포외추출물에 demethylmacrocin을 기질로 반응하여 macrocin, 3’’’-methyl demethylmacrocin, tylosin이 생산됨을 확인하였다. 생성된 유도체 중 3’’’-deoxyallosyl OMT, 3’’’-methyl demethylmacrocin은 기존에 알려지지 않은 새로운 유도체로 분석되었다. 또한 deoxyallose 당의 메틸화 순서를 확인하기 위해 tylE와 tylF가 각각 들어있는 2가지 돌연변이주의 세포외추출물에 3’’’-methyl deoxyallosyl OMT, 3’’’-methyl demethylmacrocin과 2’’’-methyl deoxyallosyl OMT, macrocin을 기질로 반응하였다. 그 결과, tylosin의 minor 경로에서 기존의 생합성 경로인 탄소 2번에서 탄소 3번 메틸화와 새롭게 예상한 경로인 탄소 3번에서 탄소 2번 메틸화 모두 생전환이 가능함을 확인하였다. 이로서 tylosin 생합성에 관여하는 유전자들이 제 기능을 수행함에 따라 tylosin 유도체의 합성 과정을 설명할 수 있었다. 또한 기존에 알려지지 않은 새로운 유도체인 3’’’-deoxyallosyl OMT, 3’’’-methyl demethylmacrocin이 생산되면서 과거에 규명된 mycinose 생합성 경로를 확인함과 동시에 새로운 tylosin 유도체를 통한 mycinose 생합성 경로를 밝힐 수 있었다.