Characterization of the Biosynthetic Route to 4,6-disubstituted Aminoglycosides using Heterologous Expression System

Abstract

본 연구는 스트렙토마이세스 베네주엘래 (Streptomyces venezuelae)를 이종숙주로 하여, 아미노글리코사이드 (aminoglycoside) 계열 항생제인 카나마이신 (kanamycin)의 생합성 경로를 규명하는 것을 목표로 하였다. 또한 이를 바탕으로 생합성 경로를 조절하고, 반합성으로 생산되는 기존의 화합물 및 새로운 유도체를 이종숙주에서 생산하고자 하였다. 본 논문의 3장에서는 아미노글리코사이드 계열 항생제인 kanamycin 생합성 경로 규명을 위하여, 일차적으로 자체 당합성 및 당전이 효소가 제거되고 최종 생산물인 아미노글리코사이드의 구조를 변경시키지 않는 스트렙토마이세스 베네주엘레 돌연변이주 YJ195를 개발하였다. 이를 이용하여, kanamycin의 생합성에 관여할 것으로 예상되는 유전자들을 발현하여, 그 기능을 분석하였다. KanA, KanB, KanK를 암호화하는 유전자의 발현을 통해 2-deoxystreptamine (2DOS)의 생산에 성공하였으며, KanF 당전이 효소 (glycosyltransferase)를 암호화하는 유전자의 발현을 통해 이 효소가 NDP-N-acetylglucosamine 뿐만 아니라 NDP-glucose도 기질로 사용하여 각각, 2’-N-acetylparomamine과 2’-deamino-2’-hydroxyparomamine이 생산되는 것을 확인하였다. 또한 KanF가 2DOS에 대한 기질로써 UDP-N-acetylglucosamine에 비해 UDP-glucose를 선호함을 밝혔으며, 이러한 결과를 통해 kanamycin의 생합성 과정이 대칭적인 (parallel) 두 개의 경로를 통해 이루어짐을 예측할 수 있었다. 나아가 kanamycin의 생합성에 관여하는 두 번째 당전이 효소인 KanE를 암호화하는 유전자의 발현을 통해, KanE 역시 기질 유연성을 가져 NDP-glucose와 NDP-kanosamine을 기질로 사용함을 확인하였다. 결과적으로 kanamycin의 생합성은 두 가지 경로를 통해 이루짐을 재확인할 수 있었다. 그 외에 나머지 kanamycin 생합성 관련 유전자들 (kanI, kacL, kanC, kanD)의 발현을 통해, KanI와 KacL은 kanamycin 화합물의 중간체인 pseudodisaccharides와 pseudotrisaccharides의 6’ 위치 탄소의 -OH를 -NH₂로 변경시킨다. KanC 및 KanD는 kanosamine의 생합성에 관여하고 완성된 NDP-kanosamine은 KanE 당전이 효소에 의해 전이됨을 증명하였다. 특히 KanI와 KacL은 pseudotrisaccharides 중에서 kanamycin X에 대한 기질 선호도가 kanamycin C에 비해 상대적으로 높아 kanamycin A가 주된 (95%) 최종 산물이 되는데 기여하였다. 이상의 in vivo 결과는 각 유전자를 발현하는 스트렙토마이세스 베네주엘레 돌연변이주의 무세포 추출물을 이용한 in vitro 실험을 통해 재확인 하였다. 본 논문의 4장에서는, 3장을 통해 밝혀진 kanamycin 생합성 경로를 조절하여, 최종 산물의 생산 비율을 변경하였다. 앞서 3장에서 밝힌 바에 따르면, kanamycin 생합성의 첫 번째 당전이 효소인 KanF는 기질로 NDP-glucose를 선호하여 결과적으로 kanamycin A가 더 많이 생산되도록 유도하는 것으로 예측되었다. 이에, 다양한 아미노글리코사이드 (neomycin, gentamicin, tobramycin)의 첫 번째 당전이 효소를 암호화하는 유전자들을 이종숙주에서 발현하여 pseudodisaccharide 중간체들의 생성 비율을 비교하였다. 그 결과, neomycin 유래의 당전이 효소인 NemD는 KanF와 같이 NDP-glucose와 NDP-N-acetylglucosamine을 모두 기질로 사용하나, 상대적으로 NDP-N-acetylglucosamine에 대한 기질 선호도가 높았다. Tobramycin 유래의 당전이 효소인 TobM1과 gentamicin 유래의 당전이 효소인 GtmG는 NDP-glucose와 NDP-N-acetylglucosamine을 선호하는 정도가 비슷하였다. 이에 pseudotrisaccharides에서도 동일한 결과가 나타나는지 확인하기 위하여, 각기 다른 당전이 효소를 암호화하는 유전자를 발현하여 kanamycins X와 C의 생산 비율을 비교하였다. 그 결과, pseudodisaccharides에서와 동일한 양상을 보임을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로, kanamycins A와 B를 생산하는 재조합 균주에서 kanF 대신 nemD로 바꾸어 발현한 결과, kanamycin A의 비율은 4배 가량 줄고 kanamycin B의 비율은 2배 가량 늘어났다. 그 결과, 또다른 유용한 아미노글리코사이드 계열 항생제인 tobramycin의 전구체로 사용될 수 있는 kanamycin B의 생산성을 증가시키는 결과를 획득하였다. 끝으로 본문의 5장에서는, 보다 유용한 아미노글리코사이드 화합물이며, 현재 반합성 (semi-synthesis)으로만 생산되고 있는 아미카신 (amikacin) 및 새로운 유도체를 이종숙주에서 생산하였다. Amikacin은 kanamycin A의 1-N 위치에 4-amino-2-hydroxybutyric acid (AHBA) moiety가 결합된 화합물로, kanamycin을 포함한 아미노글리코사이드 계열 항생제에 내성을 보이는 균주에 매우 효과적인 항생제로 사용되고 있다. 이종숙주에서 amikacin을 생합성 하기 위하여, 기존의 보고를 바탕으로 Bacillus circulans 유래의 butirosin 유전자인 btrG, btrH, btrI, btrJ, btrK, btrO, btrV 유전자를 kanamycin A 생합성 유전자와 함께 발현한 결과, 1-N-AHBA-kanamycin A (amikacin)이 생산됨을 확인하였다. 아울러, kanamycin X 생합성 유전자에 AHBA 생합성 유전자를 추가하여 발현한 결과, 기존에 보고된 바 없는 새로운 화합물인 1-N-AHBA-kanamycin X가 생산되었다. 이상의 연구 결과는 아미글리코사이드 계열 항생제인 kanamycin의 생합성 경로를 규명하고, 최종 산물의 생산 비율을 조절하였으며, 나아가 반합성 아미노글리코사이드 화합물을 이종숙주에서 생산한 첫 보고이다. 이는 향후 다양한 아미노글리코사이드 계열 항생제의 개발 및 연구에 기여할 것으로 예측된다.;The main focus of the present study was to characterize the biosynthetic route to aminoglycoside antibiotic, kanamycin using Streptomyces venezuelae-based heterologous expression system. Aminoglycoside antibiotics including kanamycin have been widely used against a variety of bacterial infections over six decades since the first use of streptomycin as an effective antibiotic in the treatement of tuberculosis. However, the pathways for aminoglycoside biosynthesis still remain unclear, due to difficultly in genetic manipulation of original strains producing this class of antibiotics. In this study, S. venezuelae was developed as a heterologous host to express aminoglycoside biosynthetic genes due to its fast growth characteristics and relative ease of genetic manipulation. Kanamycin belongs to the group of 4,6-disubstituted aminoglycosides containing a characteristic core moiety, 2-deoxystreptamine. Chapter I gives a brief overview of aminoglycosides including kanamycin. The Materials and Methods section of Chapter II provides technical information to elucidate kanamcin biosynthetic pathway. In chapter III, the kanamycin biosynthetic genes from Streptomyces kanamyceticus were heterologously expressed in an aminoglycoside non-producing strain of S. venezueale for functional analysis of kanamycin gene products. The kanA, kanB and kanK were required to biosynthesize 2-deoxystreptamine. The function of a glycosyltransferase KanF was elucidated to transfer NDP-glucose as well as NDP-N-acetylglucosamine to 2-deoxystreptamine, indicating that the presence of two parallel biosynthetic routes to kanamycin complex. A second glycosyltransferase KanE was also found to attach both NDP-glucose and NDP-kanosamine to pseudodisaccharides for generation of pseudotrisaccharides. KanI and KacL acted as 6’-dehydrogenase and 6’-aminotransferase, respectively. The KanC and KanD exhibited functional activities of 3-glucose dehydrogenase and 3-ketoglucose aminotransferase, respectively, for biosynthesis of NDP-kanosamine. This study provides new insights into the requirement for the biosynthesis of kanamycin complex and reveals the decalcomania-like symmetric kanamycin biosynthetic pathway. In chapter IV, the preference for NDP-sugar cosubstrates of aminoglycoside glycosyltransferases involved in the formation of pseudodisaccharides were compared. The kanF, nemD, tobM1, and gtmG from the gene cluster of kanamycin, neomycin, tobramycin, and gentamicin, respectively, were expressed separately in the heterologous host S. venezuelae. UDP-N-acetylglucosamine was accepted as a preferential cosubstrate in the strain expressing nemD, while the KanF showed preference for the UDP-glucose as a cosubstrate for attachment to 2-deoxystreptamine. TobM1 and GtmG displayed similar preference for the NDP-glucose and NDP-N-acetylglucosamine. Based on this result, swapping of gene encoding glycosyltransferase which has a distinct preference for the NDP-sugars resulted in the switching of the kanamycin biosynthetic flux. The recent widespread of antibiotic resistance to aminoglycosides has stimulated the search for semi-synthetic aminoglycoside analogs such as amikacin, dibekacin and arbekacin. Among several semi-synthetic aminoglycosides, amikacin and arbekacin are synthesized by the 1-N-acylation of kanamycin and dibekacin with (S)-4-amino-2-hydroxybutyric acid (AHBA) moiety. In chapter V, the genes required for the biosynthesis and transfer of AHBA together with the kanamycin biosynthetic genes were heterologously expressed in the S. venezuelae mutant bearing a deletion of native desosamine biosynthetic genes. The resulting strain produced 1-N-AHBA-kanamycin A (amikacin) and a novel aminoglycoside, 1-N-AHBA-kanamyin X. This in vivo biosynthesis of semi-synthetic aminoglycosides in the heterologous host can provide useful tools for the production of diverse aminoglycoside antibiotics. In summary, the present study provides new tools for biosynthetic and combinatorial biosynthesis of aminoglycoside antibiotics