Efficacy of recombinant adeno-associated virus 2/8-mediated gene transfer in Fabry mice

Abstract

Background: In Fabry disease, genetic deficiency of lysosomal enzyme α-galactosidase A (α-Gal A) results in abnormal Gb3 (glycosphingolipids) accumulation in endothelial cells, which leads to renal failure, cardiac and cerebrovascular disease. Methods: In this study, a pseudotyped rAAV2/8 vector encoding α-Gal A cDNA (rAAV2/8-hAGA) was generated and injected into 18-week-old male Fabry mice through the tail vein. The efficacy of the gene therapy was characterized at 6, 12 and 24 weeks after treatment. Liver, spleen, kidney, heart, and brain tissues were examined for Gb3 levels and α-Gal A enzyme activity. Gene therapy mice expression levels were compared to ERT mice. The amount of α-Gal A protein in the liver and kidney were measured by Western blotting. The renal expression was immunohistochemically identified in formalin-fixed, paraffin-embedded, frozen sections using antibodies against the α-Gal A and CD77/Gb3 proteins. The electron microscopic study was performed on the epon-embedded block from Fabry mice. Results: Treatment of Fabry mice with rAAV 2/8-hAGA resulted in the clearance of accumulated Gb3 in tissues such as liver, spleen, kidney, heart, and brain with concomitant elevation of? α-Gal A enzyme activity. Enzyme activity was elevated for up to 60 weeks. In addition, Fabry mice at 6, 12 and 24 weeks after treatment exhibited decreased Gb3 levels compared with control Fabry mice. Expression of the α-Gal A protein was identified in the presence of rAAV 2/8-hAGA vector at 6, 12 and 24 weeks after treatment. Immunohistochemical study showed α-Gal A expression in proximal tubules and glomerulus and decreased CD77 (Gb3) deposition. The α-Gal A gene transfer significantly reduced the accumulation of Gb3 in tubules and podocytes of kidney. Conclusions: The rAAV 2/8-hAGA-mediated α-Gal A gene therapy provided improved efficiency in the Fabry mouse model compared to ERT. Resulted in furthermore, recombinant AAV2/8-hAGA-mediated expression showed greater effect in kidney than enzyme replacement therapy. The data were used to evaluate the effectiveness of this approach for curing mice with Fabry disease.;연구 배경: 파브리 질환은 라이소좀의 효소인 α-galactosidase A (α-Gal A)의 유전적인 결핍에 의해 내피세포들(endothelial cells)에 비정상적인Gb3(glycosphingolipids) 축적의 결과 신부전증과 심장과 뇌혈관 질환을 일어나게 한다. 연구 방법: 본 연구에서는 pseudotyped rAAV2/8 벡터에 α-Gal A cDNA (rAAV 2/8-hAGA) 인코딩하여 생성하였고, 18주 파브리 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. 유전자 치료의 효능을 확인하기 위해 치료 후 6주, 12주, 24주 실험하였다. 간, 비장, 신장, 심장, 뇌 조직에서 Gb3 level과 α-Gal A 효소의 활성을 측정하였다. 유전자 치료 마우스와 효소 치료 마우스의 expression level을 비교 실험 하였다. 간과 신장에서의α-Gal A 단백질 양을 측정하기 위해 Western blotting을 수행하였다. 신장에서의 α-Gal A 와 CD77/Gb3 단백질의 면역조직화학상을 관찰하기 위해 포르말린 고정과 파라핀 표본과 frozen section을 사용하여 실험을 하였다. 전자 현미경 실험은 파브리 마우스의 epon 표본 블록을 만들어 수행하였다. 연구 결과: 재조합 AAV 2/8-hAGA를 치료한 파브리 마우스는 간과 비장과 신장과 심장과 뇌와 같은 조직에서 Gb3의 축적이 감소하였으며, α-Gal A효소 활성도 측정에서도 증가함을 확인하였다. 효소 활성도는 60주까지 지속되었다. 더욱더 치료 후6주, 12주, 24주 에서는 Gb3 level 이 Control 파브리 마우스와 비교하였을 때 감소됨을 확인 하였다. Western blotting 분석으로 재조합 AAV 2/8-hAGA를 치료 후 6주, 12주, 24주에 α-Gal A 단백질의 expression을 확인 하였다. 신장의 근위혈관과 사구체에서 면역조직화학실험을 통하여 α-Gal A의 양상을 확인하였고 CD77/Gb3의 축적이 감소함을 확인 하였다. 유전자 치료는 신장의 혈관(proximal tubules)과 사구체내의 족세포(podocyte)에서 Gb3의 축적을 확실하게 감소시킨다. 또한 재조합AAV 2/8-mediated 유전자 치료는 간의 독성이 없음을 확인 하였다. 연구 결론: rAAV 2/8-hAGA-mediated α-Gal A의 유전자 치료는 파브리 마우스 모델의 치료 효과를 증명하였다. 더욱더 신장에서는 재조합 된AAV 2/8-hAGA-mediated 의 expression이 효소 치료보다 더욱더 효과적임을 보여주었다. 이 자료를 통하여 파브리 질환의 치료를 위한 마우스에서의 실험방법 효율성을 평가하는데 사용 할 수 있다.