Full metadata record
DC Field | Value | Language |
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dc.contributor.author | 류지원 | - |
dc.creator | 류지원 | - |
dc.date.accessioned | 2016-08-25T10:08:51Z | - |
dc.date.available | 2016-08-25T10:08:51Z | - |
dc.date.issued | 1992 | - |
dc.identifier.other | OAK-000000055762 | - |
dc.identifier.uri | https://dspace.ewha.ac.kr/handle/2015.oak/185175 | - |
dc.identifier.uri | http://dcollection.ewha.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000055762 | - |
dc.description.abstract | 효모 알코올 탈수소효소(Yeast alcohol dehydrogenase:YADH)의 His-51잔기를 serine으로 위치특이적으로 변이시켜 얻은 H51S YADH의 pH 의존성과 diethyl pyrocarbonate 처리에 의한 효소 활성의 감소 및 잔존 효소 활성의 pH 의존성을 실험한 결과는 다음과 같다. 1. H51S YADH Ⅰ으로 pH 5.5~10.0 영역에서 kinetic studies를 실시하였을 때 각각의 kinetic constant의 pH에 대한 의존성은 ◁표 삽입▷(원문을 참조하세요) 과 같았다. 이로부터 YADH Ⅰ의 활성부위에서 형성되는 proton-relay system에서 pKa 7 또는 8.8을 보이는 아미노산 잔기가 His-51일 가능성을 생각할 수 있었다. 2. H51S YADH Ⅰ와 wild-type YADH Ⅰ에 diethyl pyrocarbonate 처리를 하였을 때 wild-type에서는 ~7의 pKa 값을 보였고 H51S의 pKa 값은 8.5였다. 따라서 7부근의 pKa 값은 His-51에 의해서 나타남을 확인할 수 있었다. 이상의 두가지 결과로 부터 YADH Ⅰ 활성에 직접 관여하는 histidine 잔기가 두개 존재함을 알 수 있었고, pKa ~7은 His-51에 해당함을 확인하였고, pKa ~8.5는 active site에서 Zn에 ligation 되어 효소활성에 관여할 것으로 생각되는 His-67에 의한 값으로 추정되었다.; Histidine-51 (according to the 'E' type horse liver alcohol dehydrogenase amino acid sequence) in yeast alcohol dehydrogenase was mutated to serine by site-directed mutagenesis and the characteristics of kinetic constants of the mutant enzyme were compared to the native enzyme. The mutant enzyme showed a linear pH dependency of log V and log (V/K_(b)), and almost constant log K_(b) values. The changes of pH dependency in mutant enzyme suggest that His-51 plays as proton acceptor in proton-relay system of alcohol dehydrogenase reaction with pK_(a)≒7. The pH effects of diethyl pyrocarbonate modification on the inactivation of H5IS-mutant and H51 wild-type yeast alcohol dehydrogenase were compared to determine the pKas of histidine residues related to enzyme activity. The pKa around 7 could be assigned to histidine-51 and pKa about 8.5 to histidine-67, on the basis of the results. | - |
dc.description.tableofcontents | 목차 = ⅲ 논문개요 = ⅸ Ⅰ. 서론 = 1 Ⅱ. 실험재료 및 방법 = 5 1. 실험재료 및 기기 = 5 (1) 실험재료 = 5 ① 균주 및 Vector = 5 ② 효소 및 조효소 = 5 ③ 배지 = 5 ④ 시약 = 6 (2) 기기 = 7 2. 실험방법 = 7 (1) Yeast alcohol dehydrogenase Ⅰ (YADH Ⅰ) 유전자의 위치특이적 변이 = 7 ① Template ss M13mp19-YADH Ⅰ DNA의 분리 = 7 ② 위치특이적인 변이와 형질전환 = 8 ③ DNA sequencing에 의한 변이의 확인 = 11 ④ subcloning = 11 (2) 변이된 YADH Ⅰ의 효모에의 형질전환과 유전자 발현 = 12 ① 효모에의 형질전환 = 12 ② YADH Ⅰ유전자의 발현 확인 = 13 ③ 효소활성측정 = 13 (3) YADH Ⅰ 효소의 분리, 정제 = 14 ① 세포추출액의 조제 = 14 ② PEG4000 분별침전의 예비실험 = 14 ③ PEG4000 분별침전 = 15 ④ DEAE-Sepharose Column Chromatography = 15 ⑤ Octyl-Sepharose Column Chromatography = 15 ⑥ Amicon concentration과 buffer exchange = 15 ⑦ 단백질 정량과 비활성 측정 = 16 ⑧ 12% SDS-PAGE = 16 (4) Kinetic studies = 17 (5) Diethyl pyrocarbonate 처리에 대한 효소활성의 변화 = 17 Ⅲ. 실험결과 및 고찰 = 20 1. YADH Ⅰ 유전자의 위치특이적 변이 = 20 2. 변이 YADH Ⅰ 유전자의 효모에의 형질전환과 유전자 발현 = 24 3. YADH Ⅰ 효소의 분리, 정제 = 24 4. Kinetic studies = 30 5. Diethyl pyrocarbonate 처리에 대한 효소활성의 변화 = 30 Ⅳ. 결론 = 41 참고문헌 = 43 Abstract = 48 | - |
dc.format | application/pdf | - |
dc.format.extent | 1902597 bytes | - |
dc.language | kor | - |
dc.publisher | 이화여자대학교 대학원 약학과 | - |
dc.title | 효모 H51S 변이 알코올 탈수소효소의 특성 | - |
dc.type | Master's Thesis | - |
dc.format.page | 60 p. | - |
dc.identifier.thesisdegree | Master | - |
dc.identifier.major | 대학원 약학과 | - |
dc.date.awarded | 1993. 2 | - |