Scanning probe microscopic studies of bio-materials and its applications

Abstract

This study is to analyze electrical properties of bio-materials such as protein and bacteria using various types of scanning force microscopy (SFM) which are based on a scanning probe method. It is known to be a very useful tool for observation of biological sample, from single molecules to cells. A variety of scanning probe techniques such as electrostatic force microscopy (EFM) can provide us both quantities and locations of charges within a biological material in addition to topographic information, and local electrostatic properties have a profound impact on structures and a function of biological system. In the first part, 2-dimensional (2-D) antibody-antigen patterns were fabricated by a soft lithography method. Fabricated patterns inhibited bacterial adhesion as a chemical and physical barrier depending on the size of protein pattern. The lattice pattern deposited by a micro-contact printing method which is 4-6 nm height was an effective barrier for the behavior of bacteria adhesion. Moreover, the EFM and Kelvin probe force microscopy (KPFM) were used for detecting electrostatic force arising from the local bound charge distribution on the antibody-antigen pattern. Results indicated that EFM signals of each pattern showed opposite electrostatic force behavior which is an important factor in the antibody-antigen binding. Especially, the KPFM measurement was used for label free detection on a simple immunoassay through electrical signals without any optical dyes. As a result, the contact potential difference within the patterned IgG region showed 50 - 70 mV variations in the KPFM measurement with a few mV of high resolution, although it was difficult to get topographic images due to small features as 4 - 6 nm height in protein arrays. In the second part, biofilms of Escherichia coli O157 :H7 and Pseudomonas aerusinosa were investigated by the EFM. The physical and topographical properties of biofilms showed a difference depending on nutrient availability and a roughness of substrate. Bacterial surface charge is an important factor for initial adhesion of bacteria during biofilm formation. Using EFM, local electrical property of a cell surface can be addressed directly while conventional zeta-potential measurement is a sum of large area signals indirectly. As a result, the biofilm formed in low nutrient media showed the faster decay of surface potential than the biofilm formed in rich media. The result indicates that neutralization of surface potential on the biofilm can be explained by the bactectial protection mechanism from an external attack such as a drug delivery in the biofilm formation. In the last part, topography and nano-particle generations on the bacterial surface of Shewanella oneidensis MR-1 were investigated by EFM. The outer membrane of bacterial cell changed under limited concentration of oxygen and protein domains were expressed on a bacterial membrane. And fast Fourier Transform analysis supported details about a periodicity of expressed protein domains on the bacteria surface. Moreover, metal-ions adsorption on bacterial surface was investigated depending on various concentrations of metal ion of Zn2+, Mn2+, and Fe2+, respectively. As a result, metal-based nano-particles were observed near and on the cell surface in the case of higher concentration of Zn2+ ions than others by transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM). The results presented throughout this thesis have revealed the bio-materials such as protein and bacteria, concerning their local structures and their electrostatic behaviors in bio-systems It shows that electrostatic force microscopic techniques can be employed to image the bio-system to a degree of resolution that is comparable to previous electron microscopy or optical microscopy and suggests a possible future role of scanning probe microscopy (SPM) in combining force sensing and dynamic studies.;본 논문에서는 주사 탐침 현미경과 이를 이용한 정전기력 현미경을 이용하여 단백질, 박테리아와 같은 생체 시료의 표면과 정전기적 성질에 대하여 연구하였다. 정전기력 현미경과 같은 여러 주사 탐침 기술들은 생체 시료의 형상뿐 아니라 전하 분포와 같은 전기적 성질을 직접적으로 측정할 수 있게 한다. 이러한 생체 시료의 국소적인 전기적 성질은 바이오 시스템의 구조와 기능을 이해하는데 있어서 매우 중요하다. 첫째로, 소프트 식각법을 이용하여 2차원 항원-항체 미세 패턴을 제작하였다. 제작한 패턴을 물리적, 화학적 장벽으로 이용하여 패턴의 크기에 따라 패턴 위에서의 박테리아의 부착 정도를 조절할 수 있었다. 마이크로 컨택 프린팅 기법으로 만들어진 격자 패턴은 4 - 6 nm 정도의 높이를 나타내면서 박테리아 부착 여부에 있어 효율적인 장벽 역할을 하였다. 또한, 정전기력 현미경을 이용하여 항원-항체 패턴의 국소적 전하 분포를 측정하였으며, 각각의 상반되는 전하 분포가 항원-항체 반응에 있어서 중요한 요소임을 보였다. 특히 정전기력 현미경은 외부 자극 물질에 광학적 표지를 하지 않고도 전기적 신호로 직접 검출할 수 있는 비표지 검출 법으로 응용될 수 있음을 보여주었다. 결과적으로, IgG 가 패턴된 지역에서의 포텐셜 차이는 50 – 70 mV 정도의 값을 나타내었으며, 이러한 측정 방법을 통하여 4 – 6 nm 정도 작은 높이를 가지는 단백질 패턴에서도 수 mV 정도의 높은 해상도를 나타내는 것을 보였다. 두 번째로, Escherichia coli O157:H7 과 Pseudomonas aeruginosa 박테리아의 생물막을 정전기력 현미경을 이용하여 관찰하였다. 생물막의 물리적, 표면적 성질은 영양분의 유무, 기판의 거칠기 정도에 따라 변화하였다. 박테리아의 표면 전하는 박테리아가 생물막을 형성하기 위한 초기 단계에서 표면 부착을 유도하게 되는데, 기존의 알려진 zeta potential 측정법과 같은 콜로이드 입자를 이용한 간접적 측정법이 아닌 정전기력 현미경의 탐침과의 반발력을 직접 이용한 측정 방법으로 박테리아의 표면 전하 분포를 측정 할 수 있었다. 결과적으로, 생물막이 낮은 영양분 배지에서 형성 되었을 때에 충분한 영양분 배지에서 형성 되었을 때에 비하여 표면 포텐셜 차이가 빠르게 감소하였다. 이러한 결과들은 생물막 형성 단계에 따라 표면 전하가 중성적으로 바뀜에 따라 약물과 같은 외부 공격에 따른 생물막 방어 기제를 정전기력 변화에 의하여 설명하였다. 마지막으로, 정전기력 현미경을 통하여 Shewanella oneidensis MR-1 박테리아의 표면 구조와 나노 입자 형성에 관하여 관찰하였다. 산소 농도에 따른 박테리아 표면의 단백질 형성에 관하여 관찰하였으며, fast Fourier Transform 분석을 통하여 박테리아 표면구조의 주기 변화를 분석하였다. 또한, 혐기 조건에서 Zn2+, Mn2+, Fe2+ 의 금속 이온 농도 변화에 따른 박테리아의 표면 전하 분포를 측정하였다. 결과적으로 금속 기반의 나노 입자들이 박테리아의 주변과 표면 위에서 관측되었으며, 특히 Zn2+ 이온 농도 증가 시 형성되는 박테리아 표면의 Zn2+ 기반의 나노 입자를 TEM과 SEM을 통하여 확인하였다. 이 논문에 나타난 결과들은 정전기력 현미경이 생체 시스템의 국소적인 구조와 정전기력 성질의 형상화하는데 있어 이용될 수 있는 가능성을 보였다. 이러한 접근 방식을 통하여 주사 탐침 현미경 기술의 발전은 새로운 생체 물질의 전기적 성질 분석 방법의 발전을 가속 및 강화 시킬 수 있을 것이다.