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사람 CYP3A4 발현 생쥐 hCYP3A4/Hepa-I 세포주 확립

사람 CYP3A4 발현 생쥐 hCYP3A4/Hepa-I 세포주 확립
Issue Date
대학원 약학과
이화여자대학교 대학원
Cytochrome P450 3A4는 사람의 간과 소장에 가장 풍부하게 존재하고 있는 형태로서 steroids, 면역 억제제, imidazole 항생제, macrolide 항생제 등 현재 사용하고 있는 약물의 60% 이상을 대사 시키는데 관여하며 aflatoxin, sterigmatocystin 등의 발암 전구 물질의 활성화, steroid 호르몬 대사에 의한 항상성(homeostasis) 유지, 약물 상호 작용에 중요한 역할을 한다. CYP3A4의 구조적, 기능적 특성을 연구하기 위해서 사람의 조직을 이용한 실험 방법은 실용적 측면이나 도덕적 측면에서 한계가 있기 때문에 높은 level의 활성을 지닌 효소를 생산하는 in vitro 실험 체계의 확립이 필요하다. 본 논문에서는 사람의 CYP3A4 cDNA를 expression vector인 pTet-Splice에 clone하여 phCYP3A4-Tet-Splice를 제작하고 이를 pTet-tTAk plasmid 와 함께 생쥐의 간세포인 Hepa-I 세포에 contransfection 하여 tetracycline에 의해 hCYP3A4의 발현이 조절되는 hCYP3A4/Hepa-I 세포 즉, 인간화된 동물 세포 모델을 개발하고자 하였다. hCYP3A4 cDNA 2.2 kb를 포함하는 phCYP3A4-pUC19 을 Sal I, Bgl I 으로 자른 2.3 kb의 DNA 조각과 Sal I 으로 자른 pTet-Splice를 ligation하여 약 9.8 kb의 phCYP3A4-Tet-Splice를 만들었다. phCYP3A4-Tet-Splice는 여러 제한 효소로 자른 결과를 분석하여 확인하였다. PCN-inducible cytochrome P450 단일항체와 alkaline phosphatase conjugated sheep antimouse immunoglobulin G를 이용해 면역 화학 반응 실험을 한 결과, 백서 간 microsome의 총 단백질 양이 증가함에 따라 검출된 P450PCN도 증가 하였고 Hepa-I 세포의 microsome에서도 총 단백질 양이 증가함에 따라 Hepa-I 세포의 microsome내 P450PCN이 증가 하였다. phCYP3A4-Tet-Splice와 pTet-tTAk를 315 ng씩 cotransfection한 Hepa-I 세포에서는 transfection하지 않은 Hepa-I 세포에서 검출된 P450PCN에 비해 약 1.9배 증가 하였고 630 ng씩 cotransfection한 Hepa-I 세포에서는 transfection하지 않은 Hepa-I 세포에서 검출된 P450PCN에 비해 약 4.2배 증가하였다. pTet-Splice vector와 pTet-tTAk을 Hepa-I 세포에 cotransfection하였을 때의 P450PCN 양은 transfection하지 않은 Hepa-I 세포에서와 큰 차이를 보이지 않았으며 phCYP3A4-Tet-Splice와 pTet-tTAk를 cotransfection하고 한달 배양한 Hepa-I 세포에서 검출된 P450PCN양은 대조군에 비해 별 차이가 없었다.;Cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) may constitute as much as 60% of all cytochrome P450 enzymes expressed in human liver. CYP3A4 is also expressed in jejunun, colon and pancreas. Numerous drugs, environmental toxins and endogenous substrates are metabolized by CYP3A4. Detailed studies on CYP3A4-dependent metabolic activation of these chemicals are needed to understand the pharmacological potency of drugs, the mechanisms causing toxicity and the drug-drug interaction. Expression of recombinant cytochrome P450s in mammalian cells has been used as a powerful tool to study these enxymes because availability of human tissue is extremely limited for practical and ethical reasons. In order to develop hCYP3A4/Hepa-I cells which are the hummanized animal cell model expressing human CYP3A4, full-length hCYP3A4 cDNA was cloned into pTet-Splice expression vector (phCYP3A4-Tet-Splice) and then, phCYPeA4-Tet-Splice was cotransfected into Hepa-I cells in combination with pTet-tTAK to make the expression of CYP3A4 regulated by tetracycline. 9.8 kb phCYP3A4-Tet-Splice was constructed by insertion of hCYP3A4 (Sal I, Bgl I fragment of phCYP3A4-pUC19) into the Sal I site of pTet-Splice. The construct was checked by restriction enzyme analyses. Immunblot assay was performed with PCN-inducible cytrochrome P450 antibody and alkaline phosphatase conjugated sheep antimouse immunoglobulin G. As microsomal protein amount increased, the detection level of P450PCN increased both in adult rat liver and Hepa-I cells. When Hepa-I cells were cotransfected with 315 ng phCYP3A4-Tet-Splice and pTet-tTAk or 630 ng phCYP3A4-Tet-Splice and pTet-tTak, the detection level of P450PCN increased 1.8-fold or 4.2-fold compared with control, respectively. The CYP3A4 cDNA expression in Hepa-I cells was not affected by cotransfection with pTet-Splice vector and pTet-tTAk. The amount of P450PCN detected in Hepa-I cells a month after transcfection with phCYP3A4-Tet-Splice and pTet-tTAk did not make significant difference from that in parental cells.
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