Engineering of whole-cell biocatalysts for cofactor-dependent oxygenations

Abstract

A. Part 1 : Oxygenation of cyclohexanone into ε-caprolactone by recombinant Corynebacterium glutamicum expressing chnB of Acinetobacter calcoaceticus The biocatalytic efficiency of recombinant Corynebacterium glutamicum expressing chnB the gene encoding the cyclohexanone monooxygenase (CHMO) of Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871 was investigated. Optimization of an expression system and induction conditions enabled the recombinant biocatalyst to produce CHMO with a specific activity of ca. 1.0 U/mg protein. Tight control of feeding of energy source (i.e., glucose) and dissolved oxygen tension during fed-batch culture-based biotransformation allowed the production of ε-caprolactone 16.0 g/l. The specific and volumetric productivities were determined to be 0.12 g/g cell dry weight (CDW)/h (17.5 U/g CDW) and 2.3 g/l/h (330 U/l), respectively. These values correspond to over 5.4- and 2.7-fold increases compared with those of the recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) expressing the same gene under the similar reaction conditions. Thus, it is concluded that the recombinant C. glutamicum is a promising biocatalyst for Baeyer-Villiger oxidation. B. Part 2 : Epoxidation of styrene into (S)-styrene oxide by chaperone and styrene monooxygenase producing recombinant Escherichia coli Biotransformation of styrene into styrene oxide by recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) expressing styrene monooxygenase genes (styAB) of Pseudomonas putida SN1 and chaperoning proteins was investigated in an organic/aqueous two-phase system, consisting of dioctylphthalate and M9 mineral medium at a phase ratio of 0.5. Overexpression of styAB at about 40% of soluble proteins and chaperoning proteins caused inhibition of cell growth but enabled the recombinant E. coli-based biocatalyst to efficiently produce (S)-styrene oxide. The final concentration of styrene oxide reached around 400 mM in the organic phase during fed-batch culture-based biotransformation for 6 h. The average specific and volumetric productivities were 110 U/g CDW and 1100 U/l, respectively. These values correspond to over 2.2- and 2.2-fold increases compared with those of the recombinant the E. coli expressing styAB of Pseudomonas sp. VLB120. These results indicate that the productivity of (S)-styrene epoxidation of E. coli can be increased by overexpressing styAB and genes encoding chaperoning proteins in recombinant E. coli.;키랄화합물의 대량생산 공정 개발은 수 십 년 전부터 생물공학자 뿐 아니라 많은 유기화학자들에게 가장 중요한 연구 목표 중 하나였다. 특히 생물전환 공정을 이용한 키랄 화합물의 생산 연구는 20 여 년 전부터 집중적인 연구가 진행되어 왔고 그 결과로 가수분해 효소에 의해 생산이 가능한 1 세대 키랄 제품은 BASF와 같은 화학회사에 의해 대량생산되고 있다. 따라서 키랄 화합물의 효율적 생합성을 위한 생촉매와 생물전환 공정을 연구하고자 한다. 구체적으로 기존에 널리 사용 중인 재조합 대장균에 비해 반응 활성이 20 % 이상 뛰어난 차세대 생촉매의 개발, 생물전환의 생산성에 영향을 미치는 인자들의 규명, 이들을 조절하여 반응산물의 생산성 극대화, 그리고 선행연구 대비 30 % 이상 키랄 화합물의 고농도 생산을 목표로 하였다. A. Part 1 : Oxygenation of cyclohexanone into ε-caprolactone by recombinant Corynebacterium glutamicum expressing chnB of Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871 유래의 cyclohexanone monooxygenase (CHMO) gene (chnB)이 발현된 재조합 Corynebacterium glutamicum의 생촉매 효율을 조사하였다. 발현 시스템과 induction 환경을 최적화시킨 재조합 C. glutamicum은 CHMO를 충분히 발현시켰고, 이 때 specific activity는 1.0 U/mg protein였다. 생물전환에 기초한 유가식 배양에서 당과 같은 에너지원과 용존산소량의 정확한 제어로 16.0 g/l의 ε-caprolactone을 생산할 수 있었다. 이 때 specific and volumetric productivities는 각각 0.12 g/g cell dry weight (CDW)/h (17.5 U/g CDW)와 2.3 g/l/h (330 U/l)였다. 유사한 반응 환경하에서 같은 chnB이 발현된 재조합 Escherichia coli BL21 (DE3)의 결과와 비교해보면 각각 5.4-와 2.7-fold 이상 증가하였다. 따라서, 재조합 Corynebacterium glutamicum이 Baeyer-Villiger oxidation를 위한 뛰어난 차세대 생촉매로 이용될 수 있음을 알 수 있었다. B. Part 2 : Epoxidation of styrene into (S)-styrene oxide by chaperone and styrene monooxygenase producing recombinant Escherichia coli Pseudomonas putida SN1 유래의 styrene monooxygenase (SMO) genes (styAB)과 샤페론이 발현된 재조합 Escherichia coli BL21 (DE3)에 의한 styrene의 styrene oxide으로의 생물전환을 dioctylphthalate과 M9 mineral medium이 0.5의 비율 구성된 organic/aqueous two-phase system에서 조사하였다. 6시간 동안 생물전환에 기초한 유가식 배양에서 organic phase에 400 mM 의 styrene oxide가 생산되었다. 이 때 specific and volumetric productivities는 각각 110 U/g CDW와 1100 U/l였다. 유사한 반응 환경하에서 같은 Pseudomonas sp. VLB120 유래의 styAB이 발현된 재조합 E. coli의 결과와 비교해보면 각각 2.2-와 2.2-fold 이상 증가하였다. 이 결과는 E. coli의 (S)-styrene epoxidation 생산성이 styAB와 샤페론이 발현된 재조합 E. coli에 의해서 증가될 수 있음을 나타낸다. 본 연구의 목표를 충분히 달성한 위의 성과물은 생물전환에 의한 키랄 화합물 생산 기술 개발에 중요한 기폭제 역할을 하리라 생각한다.