Effect of Chlorella vulgaris Intake on Antioxidative Capacity in Rats Oxidatively Stressed with Cadmium

Abstract

This Study was conducted to confirm whether how much dietary cadmium (Cd) intake and how many days could induce oxidative stress in growing rats and to investigate dietary Chlorella vulgaris (chlorella) intake would be effective on antioxidative capacity and cadmium detoxification in rats oxidatively stressed with cadmium (Cd). Oxidative stress was induced in 14-week old male Sprague-Dawley (SD) rats weighing 415.0 ± 1.6 g by Cd containing diet. They were randomly divided into two groups and fed slightly modified American Institute of Nutrition-93 Growing (AIN-93G) diet without (n=10) or with (n=40) dietary Cd (0, 200 ppm) for 8 weeks. After then, to confirm induction of stress, twenty rats fed AIN-93G diet without (n=10) and with (n=10) dietary Cd were sacrificed and compared. Other thirty rats were randomly blocked into three groups and fed slightly modified AIN-93G diets replacing 0 (n=10), 5 (n=10) or 10% (n=10) chlorella of total diet for 4 weeks. Daily food intake, body weight change, food efficiency ratio (FER), organ weight (liver, spleen, and kidney), perirenal fat pad, and epididymal fat pad were measured. To confirm safety, serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) activities, total protein, and albumin concentration were measured. To elucidate the antioxidant capacity, malondialdehyde (MDA) concentrations of plasma and liver, antioxidant enzyme superoxide dismutase (SOD) activities of erythrocyte and liver, radical generating enzyme xanthine oxidase (XO) activities in plasma and liver, ROS-dependent antioxidant heme oxygenase-1 (HO-1) activity in liver and western blotting of HO-1 were measured. To examine Cd detoxification, urinary Cd excretion and metallothonein (MT) concentrations in liver, kidney, and intestine were measured. Oxidative stress in the rats fed Cd-containing diet was confirmed by comparing with the rats fed Cd-free diet. Food intake, calorie intake, body weight change, FER, organ weight, and perirenal and epididymal fat pad weights were decreased by dietary Cd intake. Serum AST and ALT activities, total protein and albumin concentrations were within the normal reference range of SD rats. In Cd fed group, plasma MDA concentrations and plasma and liver XO activities were significantly higher, and erythrocyte and liver SOD activities were significantly lower than Cd non-fed group. Also, liver HO-1 activity and its protein expression were increased along with dietary Cd. Urinary Cd excretion and MT concentrations in liver, kidney and small intestine were increased by dietary Cd. Plasma and liver MDA concentrations and liver XO activity were reduced and erythrocyte SOD activity were increased in 5% chlorella fed group than chlorella non-fed group. Although liver HO-1 protein expression was not affected by dietary chlorella intake, its enzyme activity in 5% chlorella fed group was improved than other two chlorella treatment groups (0 and 10%). Urinary Cd excretion was not affected by dietary chlorella intake after given oxidative stress. The rats fed 5% chlorella containing diet had significantly higher hepatic MT concentrations than those fed 0% chlorella containing diet. In 14-week-old male growing SD rats, not toxicity, but oxidative stress would be induced by exposing to dietary Cd intake (200 ppm, 0.04% of total kg diet) during 8 weeks. Malondialdehyde concentrations in plasma and liver significantly decreased in 5% chlorella fed group. These result led to decreased radical generating plasma and liver XO activities and liver antioxidant HO-1 activity in 5% chlorella fed group than chlorella non-fed group, after given oxidative stress. Also, these led to increased antioxidant erythrocyte SOD activity and hepatic MT concentration in 5% chlorella fed group. After given oxidative stress, chlorella intake did not facilitate renal MT synthesis and urinary Cd excretion. And 10% chlorella intake did not have an obvious effect in antioxidative capacity and Cd detoxification, compared to 5% chlorella intake. In conclusion, without a change of ROS-dependent antioxidant protein expression, chlorella intake seemed to maximize radical-scavenging capacity through reduction of radical generation and improvement of radical elimination. These findings suggest that, after induction of oxidative stress with dietary Cd intake, chlorella supplementation, especially 5% chlorella content of total kg diet, might improve antioxidative capacity against oxidative stress rather than Cd detoxification from the body.;14주령 Sprague-Dawley (SD) 종 수컷 흰 쥐에 160 ppm의 카드뮴과 클로렐라를 포함한 식이를 10주간 섭취시켰던 선행연구에서는 카드뮴만 섭취한 군에서 산화스트레스가 유도되지 않았지만 클로렐라와 카드뮴을 동시에 섭취한 군에서는 자유기 생성 억제능과 카드뮴의 흡수 억제 효과가 관찰되었다. 선행연구의 후속으로 진행된 본 연구는 어느 수준의 카드뮴과 노출 기간이 성장기 흰 쥐에서 산화스트레스를 유발할 수 있는지와 카드뮴에 의한 산화스트레스를 받은 흰 쥐에서도 서로 다른 클로렐라 수준에 의한 항산화 방어 기전과 카드뮴 제독능을 확인하기 위하여 수행되었다. 50마리의 14주령 SD 종 수컷 흰 쥐 (415.0 ± 1.6 g)에 카드뮴 (CdCl₂ 400 ppm, 식이 무게의 0.04%)을 공급 (n=40)하거나 공급하지 않은 (n=10) 식이를 8주간 공급하여 산화스트레스를 유발하였다. 카드뮴 공급과 공급하지 않은 군에서 10마리씩 희생시킨 후, 산화스트레스가 유도되었는지 확인하였다. 나머지 30마리를 3 군으로 나누어 클로렐라를 전체 식이 무게의 0, 5, 10%로 대체하여 4주간 제공하였다. 실험동물의 식이 섭취량과 체중 증가량을 측정하였고 이를 통해 칼로리 섭취량과 식이효율을 도출하였으며, 희생 후 간, 신장, 비장, 부고환지방 및 신장주변지방의 무게를 측정하였다. 생화학적 지표로는 혈청 aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotranferase (ALT)의 활성, 총 단백과 알부민의 농도를 측정하였다. 산화스트레스의 유발을 확인하기 위해 혈장과 간의 Malondialdehyde (MDA) 농도를 측정하였으며 활성산소종을 생성하는 혈장과 간의 xanthine oxidase (XO)의 활성, 활성산소종을 제거하는 적혈구와 간의 superoxide dismutase (SOD)의 활성, ROS(Reactive Oxygen Species)에 의존적인 항산화 효소인 간의 heme oxygenase-1 (HO-1)의 활성과 그의 western blotting을 수행하였다. 또한 카드뮴의 대사작용을 알아보기 위하여 소변으로의 카드뮴의 농도, 간, 신장, 그리고 소장의 metallothionein (MT)의 수준을 측정하였다. 식이 섭취량, 칼로리 섭취량, 체중 변화량과 식이효율은 카드뮴 섭취에 의한 영향을 받았지만, 산화스트레스 유도 후 클로렐라 섭취에 의한 영향은 받지 않았다. 장기 무게 또한 카드뮴 섭취에 의한 영향을 받았으나 클로렐라 섭취에 의해서는 영향을 받지 않았다. 혈청 AST와 AL의 활성은 카드뮴이나 클로렐라에 의한 유의적인 차이가 없었다. 총 단백과 알부민 농도는 SD rats의 임상기준치에 해당하였다. 혈장 MDA 농도의 증가, 혈장과 간 XO 활성의 증가, 적혈구와 간 SOD 활성의 억제, 간의 HO-1 활성과 단백질 발현의 증가에 근거하여 카드뮴 비공급군에 비해 카드뮴 공급군에서 산화스트레스가 유발되었음을 알 수 있었다. 클로렐라 비공급군에 비교하여, 5% 클로렐라군의 혈장과 간의 MDA 농도는 낮았고, 혈장과 간의 XO 활성 또한 낮았으며, 적혈구와 간의 SOD의 활성이 증가되었다. 또한, HO-1 단백질의 발현은 클로렐라 섭취에 따른 유의적인 차이는 없었지만 간의 HO-1의 활성은 클로렐라 비공급군보다 5% 클로렐라군에서 유의적으로 향상되었다. 뇨 카드뮴 배설량과 간, 신장, 소장의 MT 농도는 식이 중 카드뮴에 의해 증가하였다. 그렇지만 산화스트레스 유발 후, 뇨 카드뮴 배설량과 신장, 소장의 MT 농도는 클로렐라 섭취에 의한 영향을 받지 못했다. 오직 간의 MT 농도만이 클로렐라 비공급군보다 5% 클로렐라 군에서 유의적인 증가를 보였다. 이상의 결과를 종합하였을 때, 8주간 200 ppm의 카드뮴 공급에 의해 XO의 활성, MDA 수준, 간의 HO-1의 활성과 그 단백질 발현이 증가하고 SOD의 활성이 유의적으로 감소한 것에 미루어 성장기 흰 쥐에서 산화 스트레스가 유도되었다는 것을 알 수 있었다. 식이 중 5% 클로렐라의 공급은 항산화 효소 (SOD, HO-1)의 활성과 자유기 생성 효소 (XO)의 활성을 향상시켰고, MDA의 생성을 감소시켰다. 또한, 5% 클로렐라를 섭취한 군에서의 증가된 간 MT의 수준은 항산화능을 향상시키는데 도움을 주는 것으로 보인다. 결론적으로, 클로렐라의 섭취는 활성산소종에 의존적인 항산화 단백질 발현에 변화를 주지는 않았지만 자유기 생성 효소인 XO의 활성을 감소시키고, 항산화효소 (SOD, HO-1) 의 활성을 향상시키며 간 MT의 합성을 증가시킴으로써 자유기 제거효과를 갖는 것으로 생각된다. 그렇지만, 산화스트레스가 유도된 후의 클로렐라의 섭취는 신장 MT 수준과 뇨를 통한 카드뮴 배설량의 증가를 촉진시키지 않는다. 그러므로 위의 결과들은 카드뮴에 의한 산화스트레스를 받은 상태에서 식이 중 5% 클로렐라를 공급할 경우, 항산화능을 향상시키는데 도움을 준다는 것을 보여준다. 이것은 자유기 생성의 감소와 제거의 촉진에 의한 것이며 체외로 카드뮴의 배출을 증가시키지는 않는 것으로 보인다.