산해박의 암세포 성장 저해 성분 연구 및 Stilbene 유도체의 암세포 사멸에 관한 연구

Abstract

그 동안 수 많은 과학자들이 암을 정복하기 위하여 항암제의 개발에 주력해 왔으나 암의 전이와 약물 다제 내성의 출현등으로 여전히 새로운 항암제의 개발이 절실히 요구되고 있다. 이러한 암 치료제의 개발을 위해서는 새로운 선도 물질의 발견이 필수적이다. 이에 본 연구에서는 천연물로부터 새로운 항암 성분을 찾고자 폐암 (A 549)과 결장암 (Col 2) 세포를 대상으로 세포 독성을 살펴보았다. 일차적으로 한방과 민간에서 널리 쓰이는 175 종의 생약을 선발하여 각각의 100% 메탄을 추출물에 대하여 폐암과 결장암 세포에 대한 sulforhodamine B(SRB) assay를 통해 세포 독성을 살펴 보았다 그 결과 청목향, 흰백미, 산해박, 원화, 속수자, 백축, 후박, 천련자, 용규초, 측백엽, 천화분등이 IC_(50) < 20㎍/㎖의 활성을 나타내었다. 이들중 민간에서 상용되며 비교적 높은 활성을 나타내고 성분연구가 많이 되어 있지 않은 산해박에 대하여 각종 칼럼 크로마토그래피 및 세포독성 실험을 병행하여 순수한 활성 물질을 분리 정제하고 구조를 확인하였다. 분리된 물질은 phenanthroindolizidine alkaloid인 antofine으로 확인 되었으며, 이는 매우 강한 세포 독성을 나타내었다 (폐암 IC_(50);3.2pg/㎖, 결장암 IC_(50);4.3pg/㎖). 한편, 결장암 세포를 이용하여 세포 독성에 관한 작용 기전을 살펴본 바, G2/M phase에서 cell cycle을 arrest 함으로써 세포독성을 나타내는 것으로 여겨진다. Antofne은 같은 속 생약인 Cynanchum vincetoxicum 에서 분리 보고 된바 있으나 우리나라 자생 식물인 산해박으로부터 처음으로 분리된 것으로 천연물 화학적 측면 뿐만 아니라 강한 암세포 성장 억제 효능을 나타낸다는 측면에서 그 의의가 크다고 하겠다. 포도 껍질과 여러가지 식품에 풍부하게 존재하는 resveratrol은 암예방과 암의 전이를 막고 암세포의 apoptosis를 유도하여 직 ·간접적으로 암화를 억제하는 것으로 최근 잘 알려진 stilbene 화합물이다. 이에 본 연구에서는 새로운 암예방, 암치료제의 개발의 일환으로 27개의 gtilbene 유도체에 대하여 사람 폐암, 결장암 세포주에서 세포독성을 검색하였으며, 이 중 11개가 활성을 보였다. 실험 결과 구조-활성 상관 관계에서 몇 종의 물질에서 cis형 물질이 기하학적인 이성체인 trans 형보다 강한 세포 독성을 보였으며, 활성 물질 중 free hydroxy보다 methoxy로 치환된 경우 더욱 강한 생리 활성을 보였다. 한편, 간단한 resveratrol 유도체인 3. 5, 2', 4'-tetramethoxy-trans-stilbene (compound 1)이 resveratrol보다 강한 생리 활성을 보였기에, 결장암 세포주에서 세포 사별에 관한 기전을 알아보고자 하였다. 그 결과 compound 1을 처리한 결장암 세포주의 flow cytometry analysis에서 apoptosis 관련 Sub G0 phase 의 생성이 처리시간에 따라 증가함이 관찰 되었고 nuclear condensation 된 것도 관찰 되었으며 현미경하에서 blebbing과 세포 모양의 변형등을 관찰하던 바, 이는 세포 사멸의 전형적인 apoptosis를 유도함을 알 수 있었다. Compound 1의 효능은 resveratrol에 비하여 강하게 apoptpsis를 유도 한다고 여겨지며 따라서 새롭게 합성된 물질 특히 compound 1은 암치료제 혹은 암예방제 개발에 있어 좋은 선도 물질로써 가능성이 제시 된다.;In order to discover novel potent antitumor agents, methanolic extracts of approximately 175 herbal medicines were prepared and primarily evaluated for cytotoxic activity with sulforhodamine B (SRB) assay in cultured human lung (A549) and colon (Col 2) cancer cells. As a result, the extracts of Aristolochia debilis, Cynanchum ascyrifolium, Cynanchum, paniculatum, Dpahne genkwa, Euphoribia lathyris, Ipomoea hederacea, Magnolia officinalis, Melia azedarach var.japonica, Solanum nigrum, Thuja orientalis, and Trichosanthes kirilowii were hound to be active in the criteria of IC_(50)<20 ㎍/㎖. In addition, based on the cytotoxic potential of the root extract of Cynanchum paniculatum, the indigenous species and not much investigated for chemical constituents, the cytotoxic principles of the extract were monitored by bioassay-guided fractionation with the methylene chloride partition by silica gel column chromatography. One compound was isolated as an active principle and characterized by insrtumental analysis; antofine, a phenanthroindolizidine alkaloid, showed a strong cytotoxic activity (A549, IC_(50) 3.2 pg/㎖; Col2, IC_(50): 4.3 Pg/㎖). In terms of action mechanism, G2/M phase of cell cycle was arrested by treatment of the compound. In addition, based on the potential of resveratrol as a modulator of carcinogenesis by inhibiting metastasis or inducing apoptosis in cancer cells, 27 stilbene analogs were evaluated for cytotoxic potential in cultured human lung and colon cancer cells. As a result, 11 compounds were shown to be active. In terms of structure-activity relationships, cis-configuration chemical structure of the active compound is more potent than the geometric isomer trans-configuration one. Generally, substitution of methoxy groups compared to free hydroxy groups in the active compound potentiated the cytotoxic activity. Prompted by the strong cytotoxic activity of 3,5,2',4'-tetramethoxy- trans-stilbene (compound 1) compared to resveratrol, the action mechanism study were performed with compound 1 in cultured Col2cells. Compound 1 induced accumulation in the sub-GO phase of the cell cycle. This result indicated that compound 1 induced apoptosis of cancer cells, and thus of interest to be a candidate for development of potential cancer chemotherapeutics or cancer chemopreventive agents.