리포터 유전자를 이용한 내분비계 장애물질 검색 및 CYP1A1 유전자 발현 조절 연구

Abstract

Endocrine system is a complex communication system of glands, hormones and cellutar receptors that control the body's infernal functions. Endocrine disruptors are exogenous substances which interfere with endorine system function. The objectives of this study were to develop and validate in vitro bioassay system for screening estrogenic and anti-estrogenic substances. ERE-Luc reporter gene assay system uses MCF-7 cell lines stably transfected with pERE-luc construct, which consists of three ERE (estrogen response element) and luciferase reporter gene. This assay is based on the estrogen receptor mediated mechanism of action and reporter gene expression is a cumulatiou of a molecular cascade of events involved in receptor transactivation. In this study, we quantitatively evaluated the estrogenic potentials of environmental samples using ERE-Luc reporter gene assay system. When we made assessments of the environment at samples from four different korea rivers, both river water samples and river sediment samples induced the luciferase activity dose dependently. And these induction were inhibited with concomitant treatment of 10-s M tamoxifen. In the MCF-7 cells transfected with phCYP1A1-luc, river sediment samples stimulated CYP1A1 transcription. These data show that river water is contaminated with various estrogenic chemicals and river sediment is contaminated with dioxin-like chemicals as well as estrogenic chemicals. A large series of flavonoids showed estrogenic activities and there were some relationship between their structure and activity. First, 4'-methoxylation and catechol structure decreased estrogenic activities. Second, hydroxylation of 3 position reduced estrogenic effect. Third, glycosides of flavonoids showed weak estrogenic activity or no activity. Interestingly, when tested at high concentrations, genistein, kaempferol, biochanin A and chrysin elicited luciferase induction higher than that of the maximum induction by estradiol. And these effect of genistein and kaempferol could not be fully inhibited with tamoxifen. Nonylphenol and octylphenol, byproducts of nonionic surfactants APE, exhibited estrogenic activities and inhibited TCDD induced luciferase activity dose dependently in HepG2 cells. Curcumin, which is reported to possess potein kinase C inhibition activity, reduced TCDD stimulated luciferase activity in dose dependent manner. In contrasts, curcumin derivatives, SB118 and Cy0l, showed inhibitory effects only in high concentrations and exhibited stimulatory effects in low concentrations.;내분비계는 인간을 비롯한 생물체에서 다양한 생리 작용을 조절하고 항상성을 유지시키는 기능을 수행한다. 이러한 내분비계에 영향을 줌으로써 생리 기능에 이상을 초래하는 외인성 물질을 내분비계 장애물질이라 하며, 내분비계장애물질은 식물에서 자연적으로 합성되는 phytoestrogen과 인위적으로 합성되는 각종 화학물질로 구분된다. 본 논문에서는 내분비계 장애물질의 생물학적 분석법을 개발하고 그 적용성을 검토하기 위해, 유전자 발현 조절 부위인 ERE와 luciferase reporter gene을 영구히 가지는 세포를 이용한 ERE-Lucreporter gene assay system으로 환경시료 및 각종 xenoestrogen의 에스로젠 효과를 정량적으로 평가하였다. 또한 phCYP1A1-luc construct transfection한 세포를 이용하여 환경시료 중에b CYP1A1 유전자 발현을 유도하는 물질의 존재 여부와 alkylphenol류 및 curcumin류가 TCDD에 의해 유도되는 CYP1A1 유전자 발현과 효소 활성에 미치는 영향을 살펴보았다. ERE-Luc reporter gene assay system을 이용하여 우리나라 하천에서 채취한 환경시료의 에스트로젠 작용을 살펴본 결과, 하천수 시료와 퇴적토 시료 모두 luciferase 활성을 증가시켰으며, ER의 부분적 길항제인 tamoxifen과의 병용 처치로 그 활성이 저해되었다. phCYP1A1을 transfection시킨 MCF-7세포에 환경시료를 처치해보았을 때 퇴적토 시료에서 luciferase 활성 증가를 보였다. 이상의 결과들로부터 하천수가 에스트로젠 작용성 물질로 오염되어 있으며, 퇴적토의 경우 에스트로젠 작용성 물질 뿐 아니라 다이옥신 유사 작용을 나타내는 물질로도 오염되어 있음을 추정할 수 있었다. 여러 가지 flavonoid의 estrogenic effect를 살펴본 결과, 그 구조와 활성사이에 및 가지 상관 관계를 발견할 수 있었다. 4' 위치에 있는 OH기의 methoxylation과 catechol 구조를 형성하는 hydroxylation은 에스트로젠 활성을 감소시켰다. 3번 위치의 hydroxylation 또한 에스트로젠 활성을 감소시켰으며, 배당체 형태의 flavonoid들은 낮은 에스트로젠 활성을 나타냈다. Genistein, kaempferol, biochanin A, chrysin은 고농도에서 estradiol 보다 더 높은 luciferase 활성을 나타내었고, genistein과 kaempferol의 경우 10^(-6) M tamoxifen 처치시에 그 활성이 부분적으로만 저해되었다. Alkylphenol ethoxylate (APE)의 분해산물인 nonylphenol과 octyphenol은 에스트로젠 활성을 나타내었을 뿐 아니라, HepG2 세포에서 TCDD에 의해 유도된 luciferase 활성을 농도 의존적으로 감소시키는 작용도 하였다. PKC 활성 저해 효과가 있는 것으로 알려진 curcumin은 MCF-7 세포에서 농도 의존적으로 TCDD에 의한 luciferase 활성 증가를 억제시켰다. 그러나 그 유도체의 경우 고농도에서만 억제 효과를 나타했고 저농도에서는 TCDD에 의한 luciferase 활성 증가를 증폭시켰다.