Collapsin Response Mediator Protein-2 Expression in Focal Ischemic Rat Brain

Abstract

Collapsin response mediator proteins (CRMPs) are a family of cytosolic proteins whose expression patterns are developmentally regulated within the nervous system. CRMP-2 exhibits the most ubiquitous neuronal expression among CRMPs. In the present study, the identification of the CRMP-2 which showed an increased expression level under ischemic condition from previous study in our lab was confirmed by 2D-PAGE and MALDI-MS analysis. In previous study, CRMP-2 was identified to appear to have a clear difference in its expression level, suggesting that CRMP-2 might be a candidate new molecule that could play an important role in brain ischemic mechanism. Therefore, the identity of CRMP-2 and its expression level in ischemic condition induced by MCA occlusion was further investigated. Changes of CRMP-2 expression level in ischemic brain were observed in a ischemic time-dependent manner by western blotting using monoclonal CRMP-2 antibody (C4G). Unexpectedly, C4G antibody labeled three separated bands and the major band (64 kDa) and the upper band (66 kDa) with less density were decreased but the lower band (62 kDa) was clearly increased in their intensity according to ischemic duration in both cortical and striatal region of the MCA-occluded rat model. This result is ensured by 2D-PAGE, as used in proteomics, and subsequent Western blotting analysis of the brain samples which were obtained from focal permanent ischemia-induced rats at 24 hours post-MCA occlusion. To examine whether the bands represent phosphorylated CRMP-2,anti-phospho-threonine antibody (p-Thr Ab) and 3F4 Ab that was known to be able detect phosphorylated CRMP-2 in Alzheimer's brain were tested. Western blotting analysis with these antibodies suggested that phosphorylated forms of CRMP-2 were not changed up to 24 hr by ischemia. Next, to assess the spatial distribution of CRMP-2 after focal cerebral ischemia, immunohistochemistry was performed on brain sections obtained from rats at 24 hours after transient MCA occlusion using C4G antibody. In normal cortex, CRMP-2 was mainly detected in pyramidal cell layer in cortex, but the new immuno-positive cells which were different from pyramidal cells morphologically appeared in upper and lower of the pyramidal cell layer at 12 hours after ischemia. CRMP-2 immunoreactivity was only weakly detected in control striatum, however, it showed quite strong intensity in ischemic striahlm. Finally, we tried to mimic the ischemic condition which was induced by MCA occlusion in animal models in vitro cell system and investigated whether the CRMP-2 expression level also changes in hypoxia-induced SH-SY5Y cells.And the decrease of 64 kDa CRMP-2 in cells also observed in focal ischemic-induced rat brain induced by MCA occlusion. It can be postulated that the differentially changed three bands observed in ischemic rat brain by CRMP-2 antibody represent distinct isoforms of CRMP-2 generated as result of alternative mRNA splicing, proteolysis, or its post-translationally modified CRMP-2. The possibility of proteolysis and alternative splicing of CRMP-2 mRNA during ischemic condition is being tested. Ischemia-induced changes in protein expression may provide important insights into the mechanisms of cellular damage and their potential recovery. The involvement of CRMP-2 in ischemic condition using rat brain and hypoxia-induced neuronal cells which suggested from the present study could provide useful information to elucidate pathophysiological mechanisms and therapeutic strategies of stroke.;Collapsin response mediator proteins (CRMPS)는 신경계의 발달을 조절하는 세포내 단백질 중 하나로, microtubule의 운동성을 조절하는 것으로 알려져 있으며, 이 중 CRMP-2는 CnMPs 중에서 가장 많이 발현되고, 신경계의 발달초기와 일부 성숙한 신경계에서 발견되고, 신경세포 안에서는 주로 growth cone, axon, cell body등에 분포한다고 알려져 있다. 본 실험에서는 허혈을 일으킨 흰 쥐의 뇌에서 CRMP-2의 발현 변화를 2D-PAGE와 MALDI-MS 분석을 이용하여 확인하였다. 그리고 CRMP-2는 허혈을 일으킨 경우에 확실한 발현의 변화를 일으키는 것으로 보아 뇌허혈의 병리기전에 있어서 중요한 역할을 할 가능성이 높은 단백질이므로 이 단백질의 발현 변화에 관한 더 많은 연구가 필요하다. 허혈을 일으킨 시간에 따른 CRMP-2의 발현변화를 보기 위해 monoclonal CRMP-2 antibody (C4G)를 사용하여 Western blotting을 한 결과, 66 과 64 kDa으로 나타나는 CRMP-2의 isoform은 허혈이 진행됨에 따라 감소하는 양상을 보였고, 62 kDa의 CRMP-2는 증가하는 것이 관찰되었다. 알츠하이머병에 걸린 환자의 뇌에서 phosphrylated CRMP-2가 증가했다는 보고가 있어 (Gu et at., 2000), ischemia에서 나타나는 isoform들 중 하나가 phosphorylated form일 가능성을 조사하였다. Monoclonal phosphorylated CRMP-2 antibody인 3F4와 phospho-threonine antibody를 사용하여 Western blotting을 해본 결과 phosphorylated form이 아닌 것을 확인할 순 있었다. 이는 또한 2D-fAGE와 C4G를 이용한 Westem blotting을 통해서도 확인할 수 있었다. 허혈을 일으킨 흰 쥐의 뇌에서 CRMP-2의 분포가 아직 보고 되지 않았으므로, C4G를 이용하여 정상 뇌와 허혈을 일으킨 뇌에서 CRMP-2의 분포를 확인했다. 정상 뇌의 경우, cortex의 pyramidal cell층에서 주로 발견되며, striatum에서는 거의 관찰되지 않는 것이 이전의 CRMP-2 mRNA의 분포에 관한 연구결과와 일치했다. 허혈을 일으킨 경우, cortex에서는 pyramidal cell이 사라지고, 또 다른 형태의 cell에서 CRMP-2가 발현되는 것이 발견되었고, striatum의 경우에는 정상 뇌보다 C4G에 대한 Immunopositive cell들이 많이 증가하는 것을 관찰하였다. 허혈을 일으킨 뇌조직에서의 CRMP-2의 발현변화가 in viro cell에서도 일어나는지 확인하기 위해 저산소증을 유발한 SH-SY5Y cell을 이용하여 CRMP-2의 발현정도를 확인하였다. 이 실험에서 동물모델에서의 허혈과 같은 조건이라고 알려진 glucose와 산소가 없는 상태에서 64 kDa의 CRMP-2의 발현 정도가 줄어드는 것을 관찰할 수 있었고, 이는 뇌 조직을 이용한 Western blotting에서 64 kDa의 CRMP-2가 감소했던 결과와 일치했다. 이 CRMP-2의 isoform들은 alternative mRNA splicing에 의한 것일 가능성이 있고 proteolysis 혹은 posttranslational modification일 가능성도 있다. 허혈을 일으킨 모델에서 단백질 발현 변화에 대한 연구는 허혈의 기전 규명이나 치료제의 개발 대상을 찾는 데에 있어 중요한 근거를 제공할 수 있다. 특히 허혈에 있어서의 CRMP-2의 발현 변화는 아직 보고 된 바가 없으므로, 허혈을 일으킨 동물 모텔과 저산소증을 유발한 신경세포에서의 CRMP-2의 발현 변화에 관한 이 연구는 허혈의 원인 규명이나 치료제의 개발에 단서를 제공할 수 있을 것이다.