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국소 뇌 허혈 흰쥐 모델에서의 대뇌 및 선조체 조직에서 발현이 변화되는 단백질의 확인

Title
국소 뇌 허혈 흰쥐 모델에서의 대뇌 및 선조체 조직에서 발현이 변화되는 단백질의 확인
Other Titles
Identification of proteins showing differences in protein expression levels in rat models of focal cerebral ischemia
Authors
이정령
Issue Date
2001
Department/Major
대학원 약학과
Keywords
국소 뇌 허혈대뇌선조체단백질
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Abstract
뇌세포에 혈액순환이 차단되는 뇌허혈 (cerebral ischemia)이 일정기간이상 지속되면 뇌세포에 손상을 유발한다. 뇌허혈은 여러 가지 임상적 상황에서 일어나며, 뇌 전체 부위에서 허혈이 일어나는 global ischemia와 뇌 내 국소 부위에서 허혈이 일어나는 focal ischemia로 분류된다. Focal ischemia는 뇌허혈의 가장 흔한 형태이며, 허혈성 손상이 가장 심하게 일어나는 중심부위(core)로부터 주변부위 (penumbra)로 손상이 퍼져나가면서 퇴행성 변화가 나타난다. 본 연구에서는 middle cerebral artery MCA) 폐쇄를 통하여 focal cererbral ischemia를 유발한 후 허혈 유발시간에 따른 손상정도를 비교하였다. Focal ischemia model은 MCA를 영구적 (pernent)으로 폐쇄하는 permanent ischemia와 MCA를 2시간 동안 폐쇄 후 재관류 시키는 transient ischemia가 있다. 따라서 permanent와 transient ischemia예서 각각 허혈 유발시간에 따른 뇌조직에서의 손상을 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)staining을 통해 비교하였다. 실험 결과, 뇌조직에서 irfarction size와 edema volume은 허혈 유발시간에 따라 증가하였다. Permanent와 transient ischemia를 유발한 시료를 비교시 infarction size와 edema volume에는 차이가 없었다. Permanent와 transient ischemia를 유발한 시료는 two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE)를 이용하여 단백질을 분리한후 허혈유발 시간에 따른 단백질 발현의 변화를 비교하였다. 반복실험에 의해 단백질 변화가 지속적으로 나타난 시료는 matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectometry (MALDI-TOF MS)를 통해 분석한 후, data base에 있는 peptide와 match시켜 화인했다. 본 실험에서는 정상 조직과 허혈을 유도한 조직에서 발현에 차이를 나타내는 5종류의 특정 단백질을 확인 할 수 있었다. Cortex에서는 TOAD-64로 불리우는 collapsin response mediator protein 2 (CRMP-2), serum albumin precursor가 permanent ischemia에서 발현이 증가되는 단백질로 확인되었고, uncoupling protein UCP-4는 감소되었다. Striatum에서는 발현이 감소된 단백질은 발견되지 않았고, cortex에서와 마찬가지로 CRPM-2와 serum albumin precursor가 permanent ischemia와 transient ischemia에서 발현이 허혈시간이 증가함에 따라 지속적으로 증가되었다. 그러나 cortex에서는 확인되지 않고, striatum에서만 발현 변화가 나타난 transferrin은 permanent ischemia에서는 허혈 유발 후 지속적으로 발현이 증가되었으나, transient ischemia에서는 허혈 유발 후 9시간 후에 발현이 증가되는 차이를 나타냈다. 중추신경계질환의 실험동물모델에서 단백질 발현 변화에 대한 연구는 그 질환의 기전 규명이나 치료제 개발 대상을 찾는 데에 있어 중요한 근거를 제공할 수 있다. Proteomics를 이용한 뇌졸중에서의 체계적인 단백질 발현의 변화에 대한 연구 결과는 아직 보고 된 바 없고, 뇌졸중 기전이 확실히 규명되기 위해서는 더 많은 관련 단백질들의 탐색이 요구되고 있다. 따라서 MCA occlusion mode에서 2D-PAGE를 이용한 단백질 발현의 변화에 대한 연구는 뇌졸중의 원인 규명에 중요한 단서를 제공할 수 있을 것이다.;Ischemic brain injury occurs in several clinical settings. Cerebral ischemia is primarily grouped into global ischemia and focal ischemia. Global ischemia showing in a clinical settings such as cardiac arrest, produces damages in a large portion of the brain (commonly the forebrain). Focal ischemia, representing a stroke which is the most common clinical setting, leads to the focal disruption of blood supply to a part of the brain, producing a significant gradation of ischemia from the core of the lesion to its outermost boundary (penumbra). In this study, first, changes in protein patterns were investigated to compare in focal ischemic rat brain tissues according to ischemic duration times. Focal cerebral ischemia was induced by MCA occlusion in rats. The permanent focal ischemia model was produced by insertion of a If mm silicone-coated 4-0 nylon surgical thread to the origin of MCA through the internal carotid artery for 3, 6, 9, 12, 24 and 48 hrs in male Sprague-Dawley rats. Transient focal ischemia model was produced by pulling the thread out of the internal carotid artery at 2 hr after MCA occlusion. The infarction volume was gradually increased by increasing MCAO time, and no significant difference in infarction volume between permanent and transient ischemic brain was observed. The cortical and striatal tissue samples obtained from the permanent and transient ischemiarat models were analyzed by two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis(2D-PACE). There were several changes of protein expression level according to ischemic duration. Spots that show consistant increase or decrease in their expression levels in repeated 2D-PACE experiments were analyzed by MALDI-TOF mass spectometry. The peptide masses were matched with the theological peptide masses of all proteins from NCBI rat data base. In ischemic cortex, the expression levels of collapsin response mediator protein-2 (CRVMP-2), also known as a TOAD-64, and serum albumin precursor were increased, but uncoupling protein UCP-4 was decreased. In ischemic striatum, CRMP-2 and serum albumin precursor were increased in their expression levels as also seen in ischemic cortex. The expression levels of transferrin was consistantly increased in striatal tissues in both permanent and transient ischemic rat models, although it was not observed in cortical tissues. The results of this study could provide useful information to elucidate pathophysiological mechanisms of stroke.
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