Controlled Release of L-arginine from PLGA Nanospheres for the Prevention of Restenosis

Abstract

재발협착증의 주원인은 혈관근육세포의 이상증식이다. 재발협착증을 방지하기 위해 혈관근육세포의 증식을 억제하는 여러 가지 국소 약물전달 시스템이 연구되어 왔다. 그러나 이러한 방법들은 혈류에 의해 약물이 빨리 씻겨나가서 원하는 조직에 효율적으로 약물이 전달되지 못하는 단점이었다. 이러한 단점을 보완하는 생분해성, 생체적합성 폴리머로 만들어진 미립자 또는 막이 국소 약물전달시스템으로 연구되었다. 그 중에서도 나노 미립화된 지속적인 약물전달시스템은 현재 이용되고 있는 카테타로 전달될 수 있을 만큼 크기도 작고 지속적으로 오랜 시간동안 약물을 방출할 수 있는 장점이 있다. 이 연구에서는 혈관세포의 증식을 억제하는 효과가 있는 약물로 보고되어 온 약물인 엘-알지닌을 함유하는 생분해성 폴리락틱-코-글라이콜릭(PLGA) 나노스피어를 재발협착증을 막기 위한 지속적인 약물전할시스템으로 개발하였다. 앨-알지닌을 함유한 PLCA 나노스피어를 제조하여 나노스피어의 형태, 크기 및 엘-알지닌의 함량을 조사하였다. 또한 제조된 나노스피어로부터의 약물의 방출양상과 혈관근육세포에 제조된 나노스피어를 투여하여 혈관근육세포의 증식에 미치는 영향을 살펴보았다. 제조된 나노스피어는 구형이며 서로 분리되었고 크기는 약 250 nm 정도였다. 여러 가지 제조조건을 변화시키며 나노스피어 내의 엘-알지닌의 함량을 증가시켰다 나노스피어 100 mg 안의 엘-알지닌의 함량은 정량 결과 최대 약 15.7 mg이었다. 제조된 나노스피어로부터 엘-알지닌의 방출은 약 10일 이상 지속되는 지속적인 방출 양상을 보였다. 엘-알지닌의 혈관근육세포에 대한 증식 억제 효과는 가역적이었고 엘-알지닌의 농도가 증가함에 따라 커졌다. 그리고 엘-알지닌 용액과 동일한 양의 엘-알지닌을 함유하도록 계산하여 제조된 나노스피어를 각각 배양한 혈관근육세포에 투여하였을 때, 두 경우 모두 비슷한 증식 억제 효과를 나타냈다. 또한 박테리아로부터 분리한 리포폴리사카라이드를 혈관근육세포에 첨가하여 inducible nitric oxide synthase (iNOS)를 유도시킨 혈관근육세포에 대해서도 엘-알지닌에 대한 영향을 살펴보았다. 리포폴리사카라이드에 의해 자극된 세포에서 엘-알지닌의 증식 억제호과가 즘더 강하게 나타났다. 이로써 배앙된 혈관근육세포에서의 엘-알지닌의 증식 억제 효과가 생체내로 재발협착증에 직접 적응될 때 더욱 효과가 있을 것이라고 판단되었다. iNOS의 존재여부에 대한 확실한 검증을 위한 NO의 정량에 대한 실험과 제조된 나노스피어의 생체 내 실험이 이러한 생체 외의 실험 결과를 더욱 확실히 해 줄 것이다. 제조된 나노스피어로부터의 엘-알지닌의 방출이 지속적이었고 방출된 약물이 혈관근육세포의 증식에 억제 효과를 보임에 따라 제조된 나노스피어는 엘-알지닌의 수송을 위한 국소 약물전달시스뎀으로 이용 될 수 있을 것으로 사료된다.;Several local drug delivery systems are currently under investigation for the suppression of vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation, which is thought to be the cornerstone of restenosis. The major disadvantages of those methods are low uptake of delivered drugs by the tissue and a rapid washout of the drugs by blood flow. To avoid these disadvantages, local drug delivery ststems made of biocompatible and biodegradable polymeric particles or membranes have been studied. Nanoparticulate sustained release carrier system is small enough in size to be delivered through the currently available balloon delivery catheters, and is able to continuously release the agent over a prolonged period of time. The administration of L-arginine, the precursor of nitric oxide, has been shown to suppress proliferation of VSMCs. With the purpose of inhibition of proliferation of vascular smooth muscle cells, biodegradable poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) nanoparticles were prepared. L-arginine loaded PLGA nanoparticles were formulated as sustained release system for the prevention of restenosis by an antiproliferative effect on vascular smooth muscle cells. L-arginine loaded PLCA nanoparticles were prepared by a double emulsion-solvent extraction method and characterized by morphology, size, and drug loading. Then the loaded nanoparticles were compared with unloaded PLCA nanosphere or free L-arginine solution on either normal vascular smooth muscle cells or the cells containing iNOS in order to examine the inhibition effect of vascular smooth muscle cell proliferation. Before the investigation of antiproliferative effect of L-arginine on VSMCs, vascular smooth muscle cells were treated with either normal media or media containing lipopolysaccharide. Lipopolysaccharide induced nitric oxide synthase from normal vascular smooth muscle cells. The prepared nanospheres were spherical and separated each other. The size of the nanospheres were between 200 and 300 nm and the L-arginine loading was about 10-15% (w/w). The inhibitory effect ofL-arginine released from the nanospehres was comparable to those observed with free L-arginine (1.0 mg/ml, 1.5 mg/ml, 3.0 mg/ml). On the other hand, placebo nanospheres, containing no L-arginine, did not show any observable effect on inhibition of cell proliferation. The inhibitory effect of L-arginine on VSMCs growth was reversible. When L-arginine was removed from the medium, the cells resumed their growth. Stimulation of VSMCs with LPS (lipopolysaccharide) induced the suppression of VSMC growth. This response was caused by the expression of inducible NOS (nitric oxide synthase) r301 and could be blocked by pharmacologic inhibitors of NOS such as L-NAME (N_(ω)-nitro-L-arginine methyl ester). Supplementation with L-arginine increased antiproliferative effect in either LPS- or L-NAME-treated cells. L-arginine released from PLCA nanospheres effectively reduced VSMC proliferation. Biodegradable PLCA nanospheres could be used to encapsulate L-arginine and may serve as a carrier for local drug delivery after PTCA (percutaneous transluminal coronary angioplasty) and in turn prevent restenosis.