Rat NDP kinase와 truncated NDP kinase (Nm23)/GST fusion protein의 효소 활성 및 생화학적 특성에 관관한 연구

Abstract

Nucleoside diphosphate (NDP) kinase는 nucleoside triphosphate의 말단 인산기를 NDP로 이동시켜 주는 효소로서 아래와 같은 ping-pong mechanism을 거치며 반응 중간체로 인산화된 phosphohistidine을 포함한다. N_(1)TP + E ↔ N_(1)DP + E-P N_(2)DP + E-P ↔ N_(2)TP + E 이렇게 생성된 NTP는 생체내 여러 종류의 생합성에 공급되고, NDP kinase는 이런 NTP의 pool 유지의 역할을 하는 것으로만 생각되어져 왔으나, 최근 NDP kinase가 암전이 억제 유전자인 nm23의 gene product와 동일하다는 것이 밝혀짐에 따라 이에 대한 연구가 활발히 진행되었다. NDP kinase는 E. coli에서부터 human에 이르기까지 다양하게 분포하여 그 sequence는 높은 동일성을 갖는다. Human NDP kinase의 경우 152 amino acid로 이루어진 약 17 kDa의 Nm23-H1과 Nm23-H2의 2개의 subunit으로 이루어져 있으며, rat의 경우 Nm23-H2와 98% 동일성을 갖는 NDP kinase α와 Nm23-H1과 95% 동일성을 갖는 NDP kinase β로 구성되어 있다. 각 subunit은 다른 기능을 가지고 있는 것으로 알려져 있는데 Nm23-H1은 일부 tumor type에서 암전이 억제 인자로 작용하며, Nm23-H2는 c-myc proto-oncogene의 promoter region에 결합하여 transcription을 활성화시키는 단백질인 PuF와 동일하다는 것이 밝혀졌다. 이외에도 cell proliferation, differentiation과 development에 NDP kinase가 작용한다고 알려져 있으나 이들의 생체 내에서의 정확한 기능과 기전에 대해서는 밝혀져 있지 않다. 본 실험에서는 brain 조직에서의 NDP kinase를 연구하기 위하여 human과 높은 동일성을 갖는 rat NDP kinase를 ATP-agarose affinity column chromatography를 이용하여 rat brain으로부터 native한 형태로 얻었으며, 각각의 isoform의 특징들을 살펴보기 위하여 recombinant NDP kinase α와 β를 순수 분리하였고, 이들 세종류의 NDP kinase의 다양한 생화학적 특성들을 비교 연구하였다. 2-Dimensional gel electrophoresis를 통한 각 subunit의 isoelectric point (pI)와 분자량을 측정하였고, 그들의 quaternary structure를 non-denaturing PAGE와 capillary electrophoresis를 이용하여 분석하였다. 효소 활성과 자가인산화의 안정성을 heat, urea 등의 처리로 살펴보았고, NDP kinase의 기능 중 다른 하나인 DNA에 결합하는 성질을 electrophoretic mobility shift assay (EMSA)를 실시하여 비교 분석하였다. Rat NDP kinase 외에도 NDP kinase가 갖는 다양한 기능들을 NDP kinase의 peptide domain 수준에서 알아보기 위하여 human NDP kinase의 각 isoform의 절반을 잘라 GST 단백질에 fusion시킨 truncated NDP kinase (Nm23)/GST fusion 단백질을 glutathione-agarose affinity column chromatography를 통해 순수 분리한 후 그들의 효소 활성과 자가인산화, DNA에 결합하는 성질들을 비교 분석하였다. 본 연구 결과에 따르면, rat NDP kinase는 각 isoform별로 효소의 안정성, 기질 특이성, DNA에 결합하는 성질이 다른 특성을 가진 것으로 나타났으며, truncated NDP kinase (Nm23)/GST fusion protein의 경우 각 isoform의 COOH 말단 반쪽과 NH_(2) 말단 반쪽의 효소 활성과 자가인산화의 성질이 다른 것으로 나타났다. NDP kinase의 각 isoform과 truncated NDP kinase의 다양한 기능과 세포 내에서의 역할에 대한 더 많은 연구가 이루어져야 될 것이다.;Nucleoside diphosphate (NDP) kinase catalyzes the transfer of the terminal phosphate group of the nucleoside triphosphate (NTP) to the correspondmg NDP and has ping-pong mechanism and involves a phosphohistidine as an intermediate of the enzyme. The primary role of NDP kinase in the cell was considered as the maintenance of a pool of nucleoside triphosphate required for the biosynthesis. Recently, the interest of NDP kinase was increased due to their identification as the product of nm23, a putative metastasis suppressor gene. NDP kinases are highly conserved set of sequences throughout evolution from bacteria to human. Human NDP kinase is composed of two subunits of 17 kDa polypeptide chain A (Nm23-H1) and B (Nrn23-H2) containing 152 amino acid sequence and rat NDP kinase has two subunits, NDP kinase α (98% homologue of Nm23-H2), NDP kinase β (95% homologue of Nm23-H1). Each subunit is thought having a distinct biological functions; Nm23-H1 as a suppressor of metastasis for some tumor type and Nm23-H2 as a transcription factor identical to PuF, a protein that binds to promoter region of c-myc proto-oncogene. Also, NDP kinase was suggested having roles in cell proliferation, differentiation, development beyond as tumor metastasis suppressor. However, the mechanism of NDP kinase was not illustrated. In this study, we have investigated the relationship between biochemical activity and structure in purified NDP kinases. Rat NDP kinase having high homology to human NDP kinase was purified from rat brain and recombinant NDP kinase α and β using ATP-agarose affinity column chromatography. Three types of rat NDP kinase were investigated in different biochemical properties. Each subunit was estimated in pI values and molecular weight using 2-dimensional gel electrophoresis and investigated in quaternary structure by non-denaturing PAGE and capillary electrophoresis. The stabilities of enzymatic activity and autophosphorylation by heat and urea and enzymatic specificities were examined, and the DNA binding properties of each isoform were compared using electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Besides rat NDP kinase, to find out the functional domains of kinase isoforms, both truncated COOH-halves and NH_(2)-halves of Nm23-H1 and -H2/GST fusion proteins were constructed, purified using glutathione-agarose affinity column chromatography and investigated in enzymatic activity, autophosphorylation patterns and DNA binding properties. These results indicated that the biochemical properties of each rat NDP kinase isoform are different depending on quaternary structure and the differences in truncated COOH-halves and NH_(2)-halves/GST fusion proteins in their biological activity could be explained as the different functions of each domain.