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Mutagenesis를 이용한 무스카린성 아세틸콜린 수용체 subtype Hm2와 Hm3의 길항제 선택성에 관여하는 부위규명에 대한 연구

Mutagenesis를 이용한 무스카린성 아세틸콜린 수용체 subtype Hm2와 Hm3의 길항제 선택성에 관여하는 부위규명에 대한 연구
Other Titles
Analysis of Domains Involved in selectivity of antagonist binding of Muscarinic acetylcholine receptor subtype Hm2 and Hm3 by Mutagenesis technique
Issue Date
대학원 약학과
이화여자대학교 대학원
무스카린성 아세틸콜린 수용체 (muscarinic acetylcholine receptor: mAChR)는 말초 및 중추 신경계에서 광범위한 신경 생리학적 작용 뿐 아니라 기억과 학습 등의 고차원적인 인식 기능에도 관련되어 있는 G protein 관련 수용체이다. mAChR는 현재 5개의 subtype이 밝혀져 있으며, 각각의 subtype은 기능과 기질과의 결합 성질이 다르다고 알려져 있다. 본 연구에서는 muscarinic 길항제의 receptor subtype에 대한 결합 선택성에 관여하는 부위를 규명하고자 하였다. 이를 위해 human m2 (Hm2) sequence를 기준으로 TM Ⅶ에서 C terminus, TM Ⅵ에서 C terminus에 이르는 부위를 Hm3의 대응 부위로 치환시킨 Hm2/3의 chimeric 수용체와, Hm2의 TM Ⅶ 부위의 두 개의 아미노산 Val과 Thr을 각각 Hm3의 대응하는 Phe과 Asn으로 치환시킨 돌연변이 수용체 (Hm2/3 V_(421)T_(423)>F_(525)N_(527))를 제조하였고, 이들 돌연변이 수용체와 wild type 수용체를 baculovirus 발현체계를 이용하여 mAChR가 결여된 곤충세포에 발현시켰다. 수용체가 발현된 곤충세포에서 DNA를 분리 정제한 후 PCR로 확인하여 DNA 수준에서의 수용체 발현을 확인하였고, Hm3 수용체는 Northern blot analysis를 통해 재조합 virus에 의해 감염된 곤충세포에서 Hm3 mRNA가 전사 (transcription) 되었음을 확인하였다. 또한, 재조합 virus로 감염된 곤충세포의 세포막 시료를 취한 후, mAChR의 비선택적 길항제인 [^(3)H]QNB를 이용해 결합 분석한 결과, 생물학적 활성이 있는 수용체 단백질이 생성되었음을 확인하였다. 수용체의 길항제에 대한 선택적 결합부위를 규명하고자 [^(3)H]QNB와 선택적 길항제들의 competition assay를 실시하여 Wild type과 돌연변이 수용체의 결합친화력 분석하였다. 그 결과는 methoctramine의 결합에는 Hm2의 TM Ⅵ이 관여하며, Hm3의 TM Ⅵ에서 C-terminus에 이르는 부위는 pirenzepine의 Hm3에 대한 고친화력 결합에 관여함을 보여준다. Hm3의 TM Ⅶ부위 중 특히 Phe_(525)와 Asn_(527) 아미노산 잔기는 4-DAMP의 선택적 결합에 중요하다. mAChR를 발현한 곤충세포의 생화학적 반응을 보기 위한 inositol 1,4,5-triphosphate (IP_(3)) assay를 실시하였다. 예상대로 Hml을 발현한 세포에서는 효능제 carbachol에 의한 수용체 자극에 따라 phosphoinositide (PI) 분해의 활성화로 IP_(3) 생성이 증가되었고 Hm2를 발현한 세포에서는 변화가 없었다. Hm3가 발현된 세포에서는 예상과는 달리 유의적인 변화를 나타내지 않았으며, 확인 실험을 필요로 한다.;Muscarinic acetylcholine receptors (mAChR) are G protein-coupled receptors which participate in an enormous variety of physiological functions in peripheral and central nervous system. They play important roles in higher cognitive processes such as memory and learning. Molecular cloning studies have revealed the existence of five mammalian muscarinic receptors (m1-m5) and individual subtypes have shown to differ in their functional and ligand-binding properties. This study is aimed to delineate the human muscarinic (Hm) receptor domains which are important in their selective binding of muscarinic antagonists. We constructed chimeric m2/m3 receptors in which a region was exchanged from TM Ⅶ to C terminus and from TM Ⅵ to C terminus of Hm2 with the corresponding domains from Hm3, and a single mutant receptor (Hm2/3 V_(421)T_(423)>F_(525)N_(527)) which two amino acids of TM Ⅶ in Hm2 were replaced with corresponding amino acids in Hm3 by site-directed mutagenesis. These mutants and wild type receptors were expressed in heterologous Sf9 cells using baculovirus expression system. We detected recombinant mAChR viral DNA from Sf9 cells infected with recombinant by PCR analysis and Hm3 mRNA transcribed in Sf9 cells by Northern blot analysis. The binding analysis was done using muscarinic non-selective antagonist [^(3)H]QNB and the result showed that the mAChR protein retained its binding activity was expressed To delineate the muscarinic receptor domains which are important in their selective binding of muscarinic antagonists, we performed the competition assay. The result showed that the high-affinity binding for methoctramine to Hm2 involved TM Ⅵ domain, and the region from TM Ⅵ to C-terminus was involved in high-affinity binding for pirenzepine to Hm3. The TM Ⅶ region, especially Phe_(525) and Asn_(527) residues, of Hm3 receptor is important in its selective binding of 4-DAMP. To study intracellular signaling pathway, Sf9 cells expressing wild type receptors were tested for their functional coupling to PI hydrolysis. IP_(3) produced by Carbachol-induced stimulation was increased in Sf9 cells expressing Hml and IP_(3) in Sf9 cells expressing Hm2 wasn't changed. Sf9 cells expressing Hm3 unexpectedly didn't show significant change and further experiment is required to identify Hm3.
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