열과 ceramide에 대한 내열성 세포의 생화학적 변화에 관한 연구

Abstract

Cells readily response to the changes of environment. If the environmental changes are called as "stress", mild stress causes a series of "stress response" and strong stress causes apoptosis (programmed cell death) or necrosis. Recently, many studies has been performed on apoptosis, and it is known that the causes of apoptosis are stresses from environment such as viral infection, bacterial toxin, oxidant, free radical, heat and compounds from cell itself such as TNF (tumor necrosis factor) family, growth factors, and neurotransmitters. Among these stresses, heat and ceramide are suggested to be involved in the same signal transduction pathway, because it has been reported that ceramide was generated when cells were exposed to heat and heat shock proteins were expressed when cells were treated with ceramide. Also, heat and ceramide treatments activated SAPK (stress activated protein kinase) which is involved in apoptosis signal transduction pathway. It has been known that mild heat shock expose makes cells be thermoresistant. If the response of thermotolerant cells to ceramide is studied, it can be contributed for the postulated signal transduction pathway. In this study, mouse fibrosarcoma cell line (RIF-1) and its thermotolerant cell line (TR-RIF-1) were used for investigating the stress responses by heat and ceramide. Before the comparisons of two cell lines, the protein synthesis patterns after heat stress and DNA fragmentation after ceramide treatment in HL-60 cells were observed. Cellular characteristics of RIF-1 and TR-RIF-1 cell lines were examined in normal conditions. The growth rate of RIF-1 (18 hr) is faster than that of TR-RIF-1 (21.8 hr) and hsc70 and hsp70 in TR-RIF-1 were more highly expressed. When the two cell lines were exposed to heat at 45℃ for various times, TR-RIF-1 was more resistant than RIF-1 in terms of cell survivals, protein synthesis, and apoptosis. However, when the two cell lines were treated with C_(2)-ceramide, RIF-1 was more resistant than TR in cell survival, protein synthesis, apoptosis. To elucidate the reason of different resistances to heat and ceramide, the fate of C_(2)-ceramide should be studied. At first, the incorporation of C_(2)-ceramide into cell membrane were examined in red blood cell system and the amount of incorporated ceramide in membrane were measured by GC-MS. The amount of incorporated C_(2)-ceramide was increased until 6 h after treatment and decreased in TR-RIF-1 cell lines, although it was sustained in RIF-1 cell lines. This results suggested that the cellular response between heat and ceramide could be developed in the separated response pathways. The metabolism of ceramide in cells are remained to be further studied and the decreased amount of C_(2)-cerarmde can be a clue for the study.;세포는 환경의 변화에 따라 점차 그 변화에 반응하게 된다 환경을 변화시키는 요소를 stress라고 할 때, 세포는 stress가 적당한 경우에 일련의 stress response를 일으키게 되고 그 강도가 더욱 세어지면 세포 사멸의 한 형태인 apoptosis가 일어나거나 또 다른 형태인 necrosis가 일어나게 된다. Apoptosis는 근래들어 특히 여러 질병과의 관련성으로 그 관심이 증대되고 있으며, 그 원인은 세포에 손상을 입히는 외부로부터의 stress나 세포 내부에서 생성되는 물질들 등으로써, 수많은 stress들에 대하여 이미 여러 방면의 연구가 되어 있다. 이러한 stress중 열과 ceramide는 세포에 처리하였을 경우 DNA ladder, 세포의 외형 변화 등이 근거가 되어 apoptosis 유발 stress로 알려져 있고, 두 stress간의 상호 연관성이 최근들어 관심의 대상으로 대두되고 있다. 세포에 열을 처리할 경우 세포 내부에서 ceramide가 생성되거나, 세포에 ceramide를 처리할 경우 세포에 열을 처리 할 때 발현되는 heat shock protein의 일종인 단백질이 발현된다는 보고가 있었고, apoptosis와 관련되어 있는 SAPK (stress activated protein kinase)가 열과 ceramide에 의해 공통적으로 활성화된다는 등이 그 예이다. 세포는 죽음을 일으키는 정도 보다는 약한 열을 처리할 경우, 내열성을 갖게 된다는 사실은 이미 널리 알려진 사실이고 이 내열성은 다른 stress들에 대하여도 저항성을 갖게 한다고 알려져 있으므로, 내열성을 가지는 세포와 정상 세포간의 ceramide에 대한 반응을 연구한다면 기존의 연구 결과로 추측된 열과 ceramide가 하나의 신호 전달 체계를 공유하리라는 가설에 대한 좋은 연구가 되리라고 생각되어졌다. 이러한 이유로 본 연구에서는 mouse fibrosarcoma인 RIF-1과 이를 45℃의 열로 stress를 주고 37℃에서 회복시키기를 여러번 반복하여 내열성을 갖게 만든 세포인 TR-RIF-1에서의 열과 ceramide에 대한 반응에 초점을 두어 실험을 수행하였다. RIF-1과 TR-RIF-1의 비교 실험 이전에 이미 apoptosis에 대한 연구가 활발히 진행되어온 세포인 HL-60 세포에서 열에 의한 단백질 합성 저해와 회복 기전을 [^(35)S]methionine을 이용한 pulse label을 통해 확인하였고, ceramide 처리시의 DNA fragmentation을 형광 현미경을 통해 확인하였다. 이를 토대로 RIF-1과 TR-RIF-1의 정상 상태에서의 성질을 비교한 후, 열과 ceramide에 대한 반응을 비교하였는데, 정상 상태에서는 RIF-1의 이분열 시간 (18 hr)이 TR-RIF-1 (21.8 hr)에 비하여 짧아 더 빠른 속도로 성장함이 확인되었으며, 단백질상으로는 TR-RIF-1에 RIF-1보다 많은 hsc70이 존재하고, 정상 상태의 RIF-1에서는 발현되지 않는 hsp70가 TR-RIF-1에서는 항상 존재함이 확인되었다. 두 세포의 stress에 대한 반응을 연구하기 위하여 열을 stress로 처리한 경우에는 예상한대로 세포의 생존률이나 단백질 합성 저해, apoptosis 발현의 측면에서 모두 TR-RIF-1이 RIF-1보다 저항성이 큰 것으로 나타났다. 그러나 ceramide를 처리했을 경우에는 RIF-1과 TR-RIF-1의 반응 차이가 열에 비하여 적었고, TR-RIF-1보다는 RIF-1의 저항성이 큰 것으로 나타났다. 이는 기존의 연구 결과로부터 예상한 것과 크게 다른 결과였으므로, 그 원인을 알아보기 위하여 C_(2)-ceramide의 세포내로의 유입 유무를 적혈구에서 확인한 후, GC-MS로 세포내로 C_(2)-ceramide가 incorporation되는 양을 측정하였다. RIF-1으로 incorporation된 C_(2)-ceramdie는 6시간의 incubation까지는 증가하다가 그 후에는 일정량으로 유지되는 반면, TR-RIF-1에서는 RIF-1과 같은 양상으로 유입되다가 6시간 이후부터는 그 양이 급속히 감소하는 것으로 나타났다. 이 결과는 heat shock에 의하여 ceramide가 생성되고, 이것이 apoptosis를 유발하는 inducer로 작용한다는 기존의 가설에 비추어 보아 heat에 대하여 저항성이 있는 TR-RIF-1 세포가 ceramide에 의한 apoptosis에 저항성이 있을 것으로 예상하였으나 결과는 그 반대로 나타났다. 이는 두 가지 추측을 가능케 하는데 첫째로는 heat shock stress와 ceramide에 의한 stress에 대한 세포의 반응이 완전히 decoupling되어 있어 서로 독립적으로 작용할 수 있다는 것이고, 둘째로는 이유는 알 수 없지만 열에 저항성이 있는 세포의 세포막이 C_(2)-ceramide에 의해 쉽게 disrupt될 수 있다는 것이다. 어떤 가능성이든 그 작용 기전은 세포내에 유입된 ceramide의 대사 과정을 더 연구함으로써 밝혀야 할 부분이며, TR-RIF-1에서 C_(2)-ceramide가 감소되는 현상으로부터 시작하여 ceramide의 대사 과정을 연구한다면, 위 결과의 원인을 밝히는데 좋은 단서가 되리라고 여겨진다.