Matrix metalloproteinase-2의 효소활성조절 기전과 stress에 의한 세포 밖 단백질의 변화에 관한 연구

Abstract

Marix metalloproteinases (MMPs)는 분자 내에 Zn^(2+) 이온을 포함하도록 합성되어 비활성 전구체로 세포 밖으로 분비되거나 세포막에 분포하여 암전이 과정에서 기저막을 분해하는 작용을 하는 단백분해효소로 알려져 있으며, 류마티스 관절염의 병소에서 일어나는 관절세포의 분해나 발암조직에서의 혈관형성과정에서 없어서는 안되는 효소이다. 이러한 MMP들 중에서 암전이 과정에서 가장 주요한 역할을 한다고 알려진 MMP2는 72 kDa의 비활성 효소 전구체로 세포 밖으로 분비되어 다른 단백분해효소등에 의해 활성화되어 62 kDa의 활성체로 변화하거나 자가활성화에 의해 더 작은 분자량의 활성을 갖기도 한다. MMP2는 내인성 저해제를 가지며 tissue inhibitors of matrix metalloproteinase (TIMP2)라고 한다. MMP2의 in vivo 상태의 효소활성은 주로 TIMP2에 의해 조절되는 것으로 보이며 그 밖의 다른 요소들도 밝혀지고 있는 중이다. MMP2의 암전이 과정에서의 중요한 역할은 곧이 저해제인 TIMP2의 항암적 작용의 의의를 부여하며 따라서 TIMP2나 MMP2에 대한 저해작용을 나타내도록 합성된 합성물질을 임상적으로 응용 하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 그에 부합하여 MMP2의 아직 정확히 밝혀지지 않은 효소활성화기전에 대한 연구도 중요성이 부각되고 있다. Nonmetastatic protein 23 (Nm23)은 세포 내 cytosol과 핵에 분포하며, nucleoside diphosphate kinase (NDP kinase)활성을 가지고 있어 세포 내 NTP pool을 유지시켜주는 역할을 한다. 그밖에 세포의 분화와 암전이 과정의 저해작용에 대한 작용이 부각되고 있으며, 세포 밖의 분포에 대한 가설이 제기되고 있으나 세포 밖에서 어떤 작용을 하는지에 대해서는 정확히 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 MMP2와 TIMP2 그리고 세포 밖 존재를 확인한 Nm23단백질과 hsp70이 45℃의 heat shock이나 serum depletion에 대하여 그 단백질 발현이 어떻게 변화하며, 어떤 상관성이 있는 지를 살펴보았으며, 세포 밖 단백질로부터 MMP2/TIMP2 혼합체와 Nm23 단백질을 분리 정제하였고, 그 각각의 단백질을 가지고 생화학적 성격을 규명하기 위한 실험을 진행하였다. 본 연구에서는 MMP2의 효소활성화 기전과 TIMP2와의 상호작용, 세포 밖 Nm23의 역할을 추정하기 위한 실험을 중점적으로 수행하였다. 또한 MMP2/TIMP2 혼합체와 함께 분리되어 나온 220 kDa의 단백질을 규명하기 위한 몇 가지 실험을 실시하였다. MMP2의 p-aminomercuric acetate와 같은 유기수은 화합물에 의한 활성화 기전에는 아직 많은 의문점이 남아 있으며, TIMP2와 결합하는 시기와 TIMP2와의 혼합체가 갖는 특성에 대하여 더 많은 연구가 진행되어야 할 것이며, 세포 밖에 존재하는 것으로 확인된 Nm23 단백질이 갖는 기능과 세포 밖에서의 역할, 기존에 밝혀진 cytosol에 분포하는 Nm23와의 동일성 여부에 대한 연구가 더 진행될 것이다. 또한 220 kDa의 단백질을 확인하기 위한 peptide sequencing 등의 실험이 계획되어 있다.;Marix metalloproteinases (MMPs) which are secreted into the extracellular space as zymogen, containing Zn atom intramolecular space. MMPs are considered to be involved in the proteolytic degradation of basement membrane in the metastatic process and other pathological lesion such as rheumatoid arthritis. MMP2 has been known to play the most important role in metastatic process including angiogenesis and tumor invasion etc,. MMP2 is secreted as 72 kDa zymogen and in vivo activated into 62 kDa fully active form by other protease and unidentified factors, and in vitro, its autoproteolytically degraded forms present the enzymatic activities as smaller proteins. MMP2 in viuo interacts with the specific endogenous inhibitor, tissue inhibitor of matrix metalloproteinase2 (TIMP2) and in vivo, its enzymatic activity seems to be regulated by TIMP2 binding and the balance with extracellular TIMPs. Because extracellular MMP2 level indicates the metastatic properties, there are many efforts to apply MMP2 as a clinical cancer metastatic marker and its inhibitors including TIMP2 and other synthesized chemicals as anticancer drugs. Nm23 suggested as a metatatic suppressor, is distributed in the intracellular cytosol and nucleus and has also enzymatic activity of NDP kinase to maintain the intracellular NTP pools. In addition, Nm23 is suggested to be involved in various cellular process including differentiation and division. The mechanism of the multifunction of Nm23 should be further explained. In this study, at first, extracellular protein changes by treating the cells with heat and serum depletion were examined and various extracellular proteins including MMP2, TIMP2, Nm23 and hsp70 were identified and identified the induction of MMP2 mRNA by serum depletion in Lovo P58. Secondly, extracellular MMP2/TIMP2 complex and Nm23 were purified from HT1080 conditioned media subsequently, and the mechanism of MMP2 enzymatic activation and interaction with TIMP2 were investigated using organomercuric chemicals. It was newly found that 220 kDa protein having gelatinase activity was associated with MMP2/TIMP2 complex in vivo. This 220 kDa protein is not known matrix proteins (Type Ⅳ collagen, Fibronectin). This characteristics of this protein should be further studied. Also the characterization of extracellular Nm23 were investigated by examining the interaction with other proteins and comparing the enzymatic activity with cytosolic Nm23. In conclusion extracellular Nm23 seems not to interact with MMP2 and TIMP2 and it has also the NDP kinase activity. In vitro, its effects on cell cycle arrest were not identified and its multifunction of extracellular Nm23 proteins should be further studied.