고성능 모세관 전기영동법을 이용한 약물 및 peptide성 생체물질의 분석에 관한 연구

Abstract

Capillary electrophoresis (CE) is perceived as an attractive tool for the analysis of pharmaceuticals and biological materials because of their high separation efficiency, easy separation and low running cost. New concept of micellar electrokinetic capillary chromatography (MECC) expanded the application of CE to the separation of neutral molecules. Validation of CE as an analytical technique for quality control (QC) of pharmaceuticals should be confirmed by quantitative analysis and the peak confirmation. In this study, the determinations of preservatives (benzoic acid, methyl-, ethyl-, propyl benzoate) in liquid formular medicines and beverages have been performed using SDS as micellar phase. The optimized preconditioning procedure and usage of internal standard were employed to obtain better reproducibility. The quantitative analyses of various type of neutral, acidic and basic components (acetaminophen, caffeine, ascorbic acid, riboflavin, thiamine, chlorpheniramine, phenylpropanolamine, dl-methylephedrine and dextromethorphan) in complex cold medicines have been also accomplished using CE. Combined methods of MECC using SDS and capillary zone electrophoresis (CZE) lowering the pH of running buffer were adopted to determine the ingredients in capsule type or liquid formular complex medicines without particular sample preparation. It was known chiral separation using CE has numerous advantages. In this study, chiral separation of amphetamine and methamphetamine has been carried out by electrokinetic capillary electrophoresis (EKC) employing β-cyclodextrin, (2-hydroxy )propylated β-cyclodextrin and carboxy-methylated-β-cyclodextrin as chiral selectors. The mechanism of interaction between chiral solutes and chiral selectors has been examined. The optimized separation method was applied for the quantitative analysis of stereoisomers in real urine samples. Another applications were shown in the analyses of peptides, proteins and enzymatic activity in this study. Hepatotoxic cyclic heptapeptides microcystin LR and RR from cyanobacteria (blue green algae) were analyzed using CE. The factors affecting the separation have been examined. Determinations of microcystin LR and RR in several Korean Lakes have been achieved by CZE and SDS-MECC and identification using UV spectra obtained from photodiode array detection. The quaternary structure and structural changes by denaturants of nucleoside diphosphate kinase (NDP kinase) have been monitored using CE. High pH running buffer in uncoated fused silica capillary was employed to investigate structural characteristics of purified native human erythrocyte NDP kinase, recombinant Nm23-H1 and H2. Quaternary structural changes by denaturants (6 M urea or 70℃ heating) and the interactions between denatured Nm23-H1 and H2. The results by this protocol from CE analysis were compared with those from the conventional SDS and non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Measurements of enzymatic (NDP kinase) activity have been performed by analysis ATP, UDP, ADP and UTP using CE. It was possible to measure the enzymatic activities of various cell cytosolic NDP kinase as well as purified enzyme. These results indicate that CE is a possible technique for QC of pharmaceutical and a powerful chiral separation method of forensic science. CE is also valuable tool to investigate the protein quaternary structure and the biological functions.;새로운 분석법인 모세관 전기영동법 (capillary electrophoresis, CE)은 분석시간이 짧고, 시료나 용매가 적게 들며, 감도와 분리능이 좋고 경제적인 여러 가지 장점을 가진다. 특히 MECC (micellar electrokinetic capillary chromatography)의 개념이 도입된 이후 전하를 띤 물질 뿐 아니라 중성분자의 분석이 가능해짐에 따라 응용범위가 크게 증가하고 있다. 본 실험에서는 CE를 약물 및 peptide성 생체물질들의 분석에 응용하였다. 먼저 CE분석법을 의약품 및 식품의 경제적인 quality control 방법으로 사용하기 위하여 필요한 정량 분석법을 확립하고자 노력하였다. 여러 가지 액상제제 약물 또는 음료에 함유되어 있는 안식향산족 보존료의 함량을 SDS (sodium dodecyl sulfate)를 이용한 MECC방법으로 분석하였다. Preconditioning이 재현성 향상에 미치는 영향을 검토하였고 최적화된 분석조건에서 내부표준물질을 사용하여 정량분석하였다. 또한 복합 감기약과 같은 여러 성분으로 구성된 OTC (over the counter) 약품이 유난히 많은 우리나라 제약 산업에 경제적인 품질관리 분석법을 제시하고자 복합 감기약에 함유된 다양한 성분들의 기존 quality control 방법보다 더 효율적인 CE분석법을 개발하였다. 9가지 약물의 동시분석을 위하여 여러 가지 계면활성제와 running buffer의 농도, pH 등이 분석에 미치는 영향을 관찰하였다. 실제 캅셀제 및 액상제제 복합 감기약 중 함유되어 있는 성분들은 특별한 시료 전처리 없이 running buffer의 pH를 낮추어 염기성 성분들을 먼저 정량분석하고 나머지 성분들은 SDS-MECC를 이용하여 정량분석 함으로써 CE를 이용한 효율적인 분석방법이 개발되었다 CE는 광학 이성질체 분석에도 여러 장점이 있는 것으로 보고된 바 있다. 본 실험에서는 약물남용 가능성이 높아 법의학에서 광학 이성질체 분석이 중요성을 갖는 amphetamine과 methamphetamine의 광학이성질체를 정량분석하기 위하여 chiral selector로 β-cyclodextrin과 유도체인 (2-hydroxy)propylated-,carboxymethylated-β-cyclodextrin을 running buffer에 첨가하여 CE로 분석하였으며 chiral separation efficiency를 비교하고 chiral selector의 분리 원리를 고찰하였다. 또한 시료주입량에 따른 분리도의 변화를 관찰하므로써 실제 시료의 분석에 적합한 조건을 확립하였다. 최적화된 분석 조건에서 내부표준 물질을 사용하여 뇨 중에 함유된 광학 이성질체를 정량분석하였다. CE는 약물 뿐 아니라 여러 생체 물질의 분석에도 사용될 수 있다. 본 실험에서는 cyclic peptide인 간독성 물질 microcystin LR과 RR의 분리를 위하여 시료 용매의 영향과 CZE (capillary zone electrophoresis)와 MECC에 의한 분리양상을 비교하였으며 국내 호수시료 중에서 이 물질들의 검출유무를 확인하였다. 또한 CE의 새로운 응용분야로서 단백질의 구조의 변화를 monitoring할 수 있는가 에 대한 연구가 수행되었다. 본 실험에서는 단백질 NDP kinase의 구조적 특성을 연구하기 위하여 분리정제된 human erythrocyte NDP kinase와 recombinant Nm23-H1, H2를 running buffer의 pH를 높여 단백질의 capillary wall 흡착을 최소화하고 native 상태와 urea와 thermal denaturation에 의한 elution profile의 변화를 관찰하였다. 이는 CE를 이용하여 단백질의 3, 4차 구조의 변화를 검출하는 것이 가능하였고, 다른 생화학적 방법으로는 검출하기 어려운 변화를 CE로 확인하므로써 CE의 새로운 응용의 장을 열였다고 하겠다. CE결과를 SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)나 nondenaturing PAGE와 같은 생화학적 실험법에 의해 얻은 결과와 비교함으로 NDP kinase의 구조적 특성을 이해하고자 하였다. CE는 여러 생화학적 반응을 관찰시에도 사용되어질 수 있다. 본 실험에서는 NDP kinase의 효소 활성을 기질과 그 반응생성물인 ATP, UDP, UTP, ADP를 CE로 분리함으로 측정할 수 있었다. Multiply negative charge를 띠는 이 성분들의 분리시 running buffer의 pH를 낮추고 전극을 음극에서 양극으로 걸어주고 CTAB과 urea가 분리도에 미치는 영향을 관찰하였다. 분석조건을 최적화하여 분리정제된 NDP kinase와 cytosolic NDP kinase의 효소활성 측정에 응용하였다. 본 연구의 결과에 의하면 CE는 의약품의 품질관리 및 광학 이성질체 정량분석를 위한 분석법으로 사용하기에 매우 적합하고, 여러 생체물질의 분리뿐 아니라 생화학적 반응의 관찰에도 이용될 수 있으며, 기존의 생화학적 분석법이 제시하지 못하는 유용한 정보를 제공할 수 있을 것으로 보여진다.