한외여과를 이용한 Lysozyme의 분리와 동정

Abstract

Lysozymes are composed of 129 amino acids with 4 S-S bonds and break the β -(1,4) linkage between N-acetylmuramic acid(NAM) and N-acetylglucosamine(NAG) which are components of Gram(-) bacteria cell wall. There are 13 different types of protein in hen egg white and lysozymes have the smallest molecular weight(MW=14,600) and highest pI(10.7). Ovalbumin(54%), ovotransferrin(13%), and ovomucoid(11%) constitute 80% of the hen egg white protein(HEWP), and have a MW of 30,000~80,000. Ovalbumin(pI 4.6), together with ovomucin(pI 4.5~5.0), ovomacroglobulin(pI 4.5~4.7) was precipitated in a pH 4.6 citrate-phosphate buffer and this prefiltered solution(PFS) was filtered through a batch membrane separation system with PM30 membrane. During membrane separation, the flux change of egg white solution depending on temperature, sample concentration, transmembrane pressure, stirring speed, and time was measured and the optimum separation conditions were determined. The protein concentrations, lysozyme concentrations, specific activities(SA), yield(%) and purification factors of PFS of different HEWP concentrations(0.25, 0.5, 0.75, l.0%(w/v), PFS) and solutions filtered through a PM30 membrane(PM30 permeate solution, PMS) were observed, therefore, an optimum concentration of 0.25% HEWP was obtained. The lysozyme separation at each step of this optimum concentration solution was analyzed and the lysozyme purity after each separation step was confirmed through chromatography. The changes in enzyme activity of the 0.25% PMS lysozyme (measured with Micrococcus luteus) affected by pH and temperature were compared to that of the commercial Sigma lysozyme. The stability of this lysozyme at 4℃ was observed for certain time. Changing the transmembrane pressure of 0.75% HEW PMS during separation at different temperatures, we could see that when the temperature as well as the transmembrane pressure increased, the flux also increased, and the highest flux was obtained at a temperature of 43℃, but the lysozyme activity was easily lost when the temperature got higher, and since the flux difference was less than 10% at 35℃, this temperature was decided as the optimum temperature. Applying the variety of concentrations and transmembrane pressures the flux increased when the concentration was low. In proportion to the transmembrane pressure, the 0.25% HEWP solution which can be divided into mass transfer controlled region and pressure-controlled region at 30 psi, was decided as the optimum concentration due to operating costs, rather than the 0.1% HEWP solution which had an almost straight growing flux. In contrast to the unstirred samples, the stirred 0.1% and 1.0% samples had a rather high flux at every applying transmembrane pressure and the higher the transmembrane pressure, the higher the flux difference between them. Also it could be said that the reason, why there was almost no flux difference between the 0.1% unstirred sample and the 1.0% stirred sample, was because although the general concentration was 10 times different, the concentration of the secondary gel layer of the unstirred sample(0.l%) was similar to that of the 1.0% stirred sample. Therefore, the optimum condition to obtain the maximum flux in membrane separation was: sample concentration 0.25%, separation temperature 35℃, transmembrane pressure 30 psi, and stirring speed 300 rpm. Since 50% of the initial flux was maintained after some time, it could be said that in the condition mentioned above, the limiting factors that affect membrane separation, could be largely inhibited. Analyzing the protein amount in the permeate(after membrane separation) of different concentrations, it was seen that the higher the sample concentration, the higher the amount of protein in the PFS. Compared to the orginal sample, 49%-56% of the protein was removed using PI differences in the PFS and 0.25% HEWP had the highest protein removing ratio. The removing ratios of protein in PMS and PFS were 99% and 98%, respectively, and were not related to sample concentrations. The lysozyme concentration in PFS increased as the solution concentration rised. The PFS lysozyme concentration was 85% of original but PMS decreased to less than 30% except for 0.25% solution and no relation was found to the increase in concentration. SA was irrelevant to concentration, and the order from high to low in SA level was: PMS 0.25%, PMS 0.5%, PMS 0.75%, PMS 1.0%. Compared to PFS, PMS SA level was from 18 to 31 times higher. This implied that most of the non-enzymatic proteins that were in the egg white were removed during the membrane separation process, and only the lysozymes were selectively passed through the membrane. Among the four concentrations, the 0.25% HEW solution had the highest purification factor, therefore the optimum concentration in the batch system was decided to be 0.25%. Analyzing the samples obtained in each separation step using gel chromatography, showed two clear peaks - enzymatic and non-enzymatic region. But different from the prefiltration separation step in which only a small amount of lysozyme was removed, after an ultrafiltration also most of the non-enzymatic proteins were eliminated as retentate. At certain substrate concentration, when the Sigma lysozyme (SL) and 0.25% PMS lysozyme(PMSL) concentration increased, the initial velocity(V_(o)) also increased, and the enzyme activity of PMSL was 10 times higher than that of SL. At certain enzyme concentration, the reaction showed first-order kinetics when the substrate level was less than 3.0 mg/mL, and zero-order kinetics when the level was higher than 3.0 mg/mL. The V_(max) of SL and PMSL obtained using the Lineweaver-Bulk plot was 0.054 and 0.086, respectively, and K, was 0.103 and 0.263. But considering that the concentration of PMSL was 10 times lower than SL, it indicated that PMSL had a high affinity for substrate and enzyme activity. The optimum pH for both SL and PMSL was 5.8. The higher the reaction temperature, the faster the reaction speed. The optimum temperature was 60℃ with decreasing V_(o) at higher temperatures due to protein denaturation. The transition temperature of PMSL was 45℃ and the reaction speed was 3 times faster at 45-60℃ than 5-45℃. PMSL was very stable when stored for 6 months at refrigeration temperature. Compared to SL, PMSL obtained by membrane separation had a 10 times higher enzyme activity (maximum at pH 5.8, 60℃) and was stable when stored at low temperatures. Therefore, the membrane separated lysozyme was shown to be used as a suitable natural preservative in the food processing industry.;Lysozyme은 129개의 아미노산으로 구성되어 있으며 4개의 S-S 결합을 가진 효소로서 Gram-(-) 균의 세포벽을 구성하고 있는 N-acetylmuramic acid(NAM)와 N-acetylglucosamine(NAG)사이의 β(1-4) 결합을 분해한다. 달걀 흰자에는 약 13종의 단백질이 존재하는데 달걀 흰자 단백질 중 lysozvme은 분사량(MW=14,600)은 제일 작은 반면 pI(10.7)는 가장 높다. 난백의 약 80％를 차지하는 ovalbumin(54％), ovotransferrin(13％), ovomucoid(11％)는 MW 30,000∼80,000의 단백질들이며, 이 중 ovalbumin의 pI는 4.6으로 ovomucin(pI 4.5∼5.0), ovomacroglobulin(pI 4.5∼4.7)과 함께 pH 4.6 citrate-phosphate buffer로 침전시킨 후 회분식 막 분리 장치에서 PM30 막을 이용하여 분리하였다. 막 분리시 온도, 시료 농도, 막 횡단 압력, 교반속도, 시간에 따른 난백 용액의 flux 변화를 측정하여 최적 분리 조건을 결정하였고 이 최적 분리 조건하에서 농도를 달리한 0.25％, 0.5％, 0.75％, 1.0％(w/v) 난백 단백질(hen egg white protein, HEWP)용액을 예비 여과하여 얻은 여액(pre-filtered solution, PFS)과 35℃에서 PM30 막으로 한외 여과하여 얻은 여액(PM30 permeate solution, PMS)의 단백질 농도, lysozyme 농도, specific activi쇼(SA), yield(％) 및 purification factor를 계산하였으며 최적 농도로 결정된 0.25％ HEWP 용액의 각 단계별 lysozyme의 분리도를 분석하고 크로마토그래피를 이용하여 한외여과 단계를 거친 여액내의 Iysozyme의 순도를 확인하였다. 또한 Micrococcus luteus에 대한 상업용 (Sigma) lysozyme과 0.25 PMS lysozyme의 효소 활성을 비교하고 pH와 온도에 대한 효소 활성변화를 측정하였으며 일정기간동안 냉장 온도에서 lysozyme의 안정성을 살펴보았다. 온도를 달리한 0.75％ HEWP PMS용액에 압력을 변화시키면서 막분리 한 결과 온도와 막 횡단 압력이 상승할수록 flux가 증가하여 43℃에서 flux가 가장 높았으나, 온도가 높을수록 lysozyme이 활성을 상실하기 쉽고 35℃와 flux 차이가 10％ 미만이므로 최적 온도를 35℃로 결정하였다. 다양한 농도와 막 횡단압력을 적용하였을 때 농도가 낮을수록 막 횡단 압력이 증가할수록 flux가 증가하였는데 막 횡단 압력 증가에 비례하여 거의 직선적으로 flux가 증가하는 0.1％ HEWP 용액보다는 운용비용 측면을 고려하여 막 횡단 압력 30psi에서 mass transfer controlled region과 pressure-controlled region으로 구분되는 0.25％ HEWP 용액을 최적 농도로 결정하였다. 모든 막 횡단 압력에서 교반 0.1％와 1.0％ 시료가 비교반 시료에 비하여 flux가 상당히 높았으며 막 횡단 압력이 높아질수록 이들간 flux 차이가 컸다. 또한 비교반 0.1％와 교반 1.0％ flux 차이가 거의 없는 것은 용액의 전체적인 농도차이는 10배 이지만 비교반 0.1％ 용액내 형성된 2차 겔층의 농도가 1.0％와 비슷한 농도이기 때문인 것으로 사료된다. 그러므로 flux를 최대화하는 막 분리 최적 조건은 시료 농도 0.25％, 분리 온도 35℃, 막 횡단 압력 30psi, 교반속도 300 rpm이었으며 시간이 경과하여도 초기 flux의 50％ 이상을 유지하는 것으로 보아 이 조건이 막 분리 제한 요인을 가장 효과적으로 억제하는 것으로 판단되었다. 농도를 달리한 시료의 막 통과 여액내 단백질 농도 분석결과 예비 여과된 시료의 단백질 농도는 시료의 농도가 증가함에 따라 증가하였는데, 원 시료에 비해 pI를 이용하여 49∼56％의 단백질이 예비여과 단계에서 제거되었으며 0.25％ HEWP 용액의 단백질 제거율이 가장 높았다. PMS와 PFS에서 각각 원시료의 99％와 98％에 해당하는 단백질이 제거되었으며 시료의 농도와는 무관하였다. Lysozyme의 농도는 PFS의 경우 시료의 농도 증가에 따라 비례적으로 증가하였으며 원시료 lysozyme 농도의 85％였으나, PMS는 0.25％를 제외하고는 30％ 미만으로 감소하였으며 농도 증가에 비례하지는 않았다. SA는 농도와 무관하였는데 SA가 높은 순서는 PMS 0.27％＞ PMS 0.5％＞PMS 0.75％＞ PMS 1.0％ 순이었다. PFS와 비교하였을 때 PMS의 SA는 최저 18배에서 최고 31배 가량 높았다. 이러한 사실들은 막 분리 단계를 거치면서 난백 단백질의 상당량을 차지하고 있던 다른 단백질들은 거의 대부분이 제거되었으며 분자량이 14,600인 lysozyme만이 선택적으로 막을 통과하였음을 의미한다. 이상의 결과와 더불어 4가지 농도의 시료 중 0.25％ HEWP 용액의 purification factor가 가장 높았으므로 회분식 막 분리 장치에서 최적 농도를 0.25％로 결정하였다. 최적 조건으로 결정된 0.25％ HEWP의 각 분리 단계별 시료를 겔 크로마토그래피를 이용하여 분석해본 결과 예비여과단계 이후의 시료는 비효소 분획과 효소 분획 두 개의 peck로 뚜렷이 구분되었다. 그러나, 한외여과단계를 거친 여액에서는 예비여과단계에서 일부분만 제거되었던 lysozyme 이외의 비효소 단백질이 거의 대부분 제거된 것으로 나타났다. 일정 기질 농도에서 Sigma lysozyme(SL)과 0.25％ PMSL(PM30 permeate 1ysozyme)의 농도가 증가할수록 V_(o)도 증가하였으며 PMSL이 SL에 비해 효소 활성이 10배 가량 높았다. 일정 효소 농도에서 0.3 mg/mL 미만의 기질 농도에서는 V_(o)가 first-order kinetics를, 0.3 mg/mL 이상의 기질 농도에서는 zero-order kinetics를 따랐다. Lineweaver-Bulk plot를 이용하여 구한 V_(max)와 K_(m)값은 SL이 각각 0.054, 0.103이었고 PMSL은 0.086, 0.263이었으나 PMSL이 SL에 비해 농도가 10배 낮은 점을 고려한다면 PMSL의 효소 활성과 기질에 대한 친화력이 매우 높음을 알 수 있었다. SL과 PMSL 모두 최적 pH가 5.8이었다. 온도가 증가할수록 반응 속도도 증가하였는데 SL과 PMSL의 최적 온도는 60℃였으며 60℃ 이상에서는 단백질이 변성하여 V_(o)가 급격히 감소하였다. PMSL의 활성화 에너지 측정 결과 전이온도는 45℃였으며 25℃∼45℃보다 45℃∼60℃에서의 반응속도가 3배 더 빨랐다. 냉장 온도에서 6개월간 보관시 PMSL의 안정성이 상당히 높은 것으로 나타났다. 그러므로 SL에 비하여 막분리 공정을 거쳐 얻은 PMSL은 효소 활성도가 10배 가량 높았고 pH 5.8, 온도 60℃에서 최대의 활성을 나타내었으며 장기간의 냉장 보관에서도 효소의 안정성이 매우 높아 식품용 천연보존제로 사용하기에 적합하였다.