에탄올에 의한 세포의 apoptosis와 내성에 대한 연구

Abstract

Ethanol results in the development of resistance in animals and some cells. However, the molecular mechanism underlying this action is not well understood. In this study, ethanol resistance were induced in HL-60 cells, RIF-2 and TR-RIF-1 cells, and the biochemical parameters such as apoptosis, DNA repair, cytosolic Ca2+ concentration, intracellular GSH contents were investigated to elucidate the mechanism. To obtain ethanol resistant cells, HL-60 cells were treated with 1% ethanol for 24 hour, and followed by 2% ethanol treatment, and the cell survivals of these cells were determined by trypan blue exclusion method. Detections of DNA fragments caused from cell apoptosis were carried out by agarose gel electrophoresis and the total amounts of DNA fragments were measured by diphenylamine method. DNA repair capacities were determined by measuring unscheduled DNA synthesis and the amounts of cytosolic Ca^(++) were measured using fluorescent probe, fura-2/AM by fluorescence spectrophotometer. Contents of intracellular GSH were determined as total amounts of GSH and GSSG. Induction of ethanol resistance was confirmed in radiation induced mouse fibrosarcoma(RIF-1) and thermotolerance induced TR-RIF-1 treated with 4% ethanol after the first 2% ethanol for 24 hour. Characteristics of ethanol resistant cells have been demonstrated as increased survival by ethanol treatment, decreased apoptosis by stresses, decreased cytosolic Ca^(++) concentration which may present the correlation between these phenomenon. Ethanol resistant cells treated with 2% ethanol could maintained higher GSH level than control cells and only 2% ethanol treated cells, which indicated that the antioxidant might play a role in ethanol resistant cells. It seems as though the change in DHA repair capacity does not coincide with other biochemical parameters tested here in ethanol resistant cells.;에탄올은 동물과 일부 세포에서 내성을 유도한다. 그런데 이 내성에 대한 기전은 잘 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 사람 백혈병 세포인 HL-60 세포에서 에탄올을 처리하였을 때와 에탄올에 대한 내성이 유도되었을 때 세포내 생화학적인 변화인 apoptosis, 세포질의 Ca^(++) 농도, 세포내 GSH 양, DNA repair의 변화를 관찰하여 내성 기전을 밝히고자 하였다. 에탄올 내성 세포를 얻기 위하여 HL-60 세포를 1% 에탄올로 24시간 처리한 후 2% 에탄올을 처리하였으며 이 때의 세포생장율은 trypan blue exclusion 방법으로 결정하였다. 에탄올에 의하여 유도되는 apoptosis에서는 DNA fragmentation을 확인하기 위하여 agarose electrophoresis를 행하였고, fragmented DNA 정량은 diphenylamine법으로 실시하였다. DNA repair capacity는 unscheduled DNA synthesis로 결정되어졌으며, 세포질 Ca^(++)농도는 fura-2/AM을 사용하여 flourescence spectrophotometer로 측정하였다. 세포내 GSH양은 GSH와 GSSG를 포함한 양으로 결정되었다 또한 에탄올에 의한 내성이 다른 세포에서도 유도되는지와 열에 내성이 있는 세포에서도 유도되는지를 확인하기 위하여 광선 조사에 의해 유도된 mouse의 fibrosarcoma (RIF-1)와 열에 내성이 있는 TR-RIF-1 세포를 이용하였으며, 각각 2% 에탄올을 24시간 동안 처리한 후 4% 에탄올을 처리하였을 때 내성이 생김을 확인하였다. 에탄올 내성이 생긴 세포는 증가된 세포 생존율, 감소된 apoptosis 양과 apoptosis 감소에 따른 세포질내의 Ca^(++) 농도 감소의 상관관계를 보여주었다. HL-60 세포에 2% 에탄올을 처리하여 세포내 GSH양을 관찰하였을 때, 에탄올에 대한 내성이 생긴 세포에서는 2% 에탄올만 처리된 세포에 비해 세포내 GSH가 높은 양을 유지함을 보여줌으로써 에탄올 내성에 대한 항산화제 역할을 보여준다. DNA repair capacity는 에탄올에 의한 내성이 생긴 세포에서 apoptosis에 대한 내성을 유도하는 세포내 생화학적 변화와는 다른 기전이 있는 것으로 보인다.