쥐 선조체에서 N-methy1-D-aspartate(NMDA)와 non-NMDA 수용체 자극으로 유도된 산화적 스트레스와 신경손상에 대한 멜라토닌의 영향

Abstract

The excessive activation of excitatory amino acid receptors induces excitatoxicities which can be characterized by triggered cell death and formation of reactive oxygen free radicals. Stimulation of both kainic acid (KA), NMDA sensitive glutamate receptor has been reported to trigger neuronal and DNA damage, and induce generation of oxidative free radicals. The pineal hormone melatonin can affect the functioning of neuronal cells by at least two mechanisms: (1) via specific G-protein-coupled receptors and (2) through its antioxidative action, which induces the scavenging of free radicals and stimulation of the activities of antioxidant enzymes such as glutathion peroxidase. In vitro, melatonin has been shown to be capable of protecting primary neuronal culture from cell death induced by the excitatoxicity. In the present work, we studied the protective effects of melatonin against the oxidative stress and neuronal damage mediated by non-NMDA (KA)-and the NMDA-receptor in rat striatum. Melatonin implants consisting of 22-gauge stainless-steel cannule with melatonin fused inside the tip were placed bilaterally in the rat brain one week prior to instrastriatal injection of glutamate receptor subtype agonists. Melatonin showed protective effects against the elevation of lipid peroxidation induced by either KA or NMDA, which were intrastriatally injected one week before the extraction of the rat brain. Melatonin showed somewhat larger protective effect than that by DNQX (2 ㎍), a KA-receptor antagonist, on KA-induced lipid peroxidation, and similar effect relative to that by MK801 (3 ㎍), an NMDA-receptor antagonist, on NMDA induced lipid peroxidation. Melatonin also recovered of Cu,Zn-SOD activities decreased by both KA and NMDA into the control level. Cu,Zn-SOD activity was increased by 1-2-amino-4-phosphonbutanoic acid (ACPD) which is a glutamate metabotropic receptor agonist at 1 μmol, and further increased when melatonin was pretreated one week before the injection of ACPD. Melatonin also clearly blocked both KA- and NMDA-receptor mediated neuronal damage as monitored by the changes in choline acetyltransferase activity and by microscopic observation of rat brain section stainned with cresyl violet. The results indicate that protective effect of melatonin is prominent against striatal damages from oxidative stress mediated glutamate receptors, both non-NMDA (KA) and NMDA receptor and is comparable to the protective effects of DNQX and MK801 which are KA- and NMDA-receptor antagonist, respectively.;흥분성 독성은 뇌에 존재하는 흥분성 아미노산 수용체가 효능제들의 지속된 또는 과도한 자극에 의해서 비정상적 흥분을 일으킴으로서 신경 괴사를 일으켜 신경을 파괴시키는 현상이고 반응성 산소 유리기와 함께 산화적 스트레스를 유발하는 대표적인 원인이다. 이러한 흥분성 독성은 반응성 산소기의 발생과도 밀접하게 관련되어 있는데, 흥분성 독성에 의한 신경사망은 반응성 산소기의 발생을 유발시키며, 이 반응성 산소기는 다시 흥분성 아미노산의 유리를 촉진하는 것으로 보고되었다. 일단 신체 내에서 발생되는 반응성 산소 유리기는 주변의 불포화 지방산 측쇄, 단백질, DNA 등을 변성시켜 산화적 스트레스에 의한 신경손상을 일으켜 신경 퇴행성 질병등의 원인이 되며, parkinson's disease의 간접적인 원인으로도 생각되어지고 있으며 '노화 (aging)' 역시 궁극적으로는 산화적 스트레스가 세포에 축적됨으로써 일어나는 현상으로 이해되고 있다. Melatonin은 serotonin을 전구물질로 합성되는 물질로 인간을 포함한 모든 동물계의 모든 세포에서 빛을 외부의 신호로 감지하여 주기적인 신체의 변화를 유도하는 호르몬으로서의 역활과, 면역계와 항산화 방어 체계에서 외부 자극에 대한 방어를 담당하는 물질이다. Melatonin의 항산화 효능은 가장 유독한 반응성 산소기인·OH에 대한 직접적인 scavenging 능력과 간접적으로는 체내 방어목적으로 존재하는 항상화 효소인 Cu,Zn/Mn- superoxide dismutase (SOD)와 catalase, glutathion peroxidase 등의 활성을 증강시키는데 있다. 따라서 melatonin은 강력한 항산화 효능제로서 많은 질병에 있어서 예방과 초기 단계에 있어서 주목할 만한 보호제로서 작용할 수 있음이 제시되어 왔고 실제로 여러 실험을 통해 그 가능성을 입증했다. 본 논문의 목적은 약물들을 쥐 뇌 선조체에 직접 주입하는 in vivo 실험을 통하여 대표적인 흥분성 아미노산 수용체인 glutamate 수용체의 과도한 활성에 의해서 유발되어지는 신경의 산화적 스트레스를 melatonin이 억제할 수 있는가를 조사하고, 이러한 melatonin의 보호작용이 glutamate subtype 수용체를 경유한 흥분성 독성에 대해 subtype간에 어떠한 차이를 보이는가를 관찰하는 것이다. 따라서 glutamate의 ionotropic 수용체인 N-metyl-D-aspartate (NMDA) 수용체의 효능제인 NMDA와 non-NMDA 수용체의 효능제인 kainic acid (KA), 그리고 metabotropic 수용체 (mGluR)의 효능제인 1-2-amino-4-phosphonbutanoic acid (ACPD)를 과도한 양을 투여하여 세포손상을 유발시키고 이에 의한 신경사망을 측정한 후, melatonin 전 처치에 의한 보호 효과를 비교함으로써 melatonin의 효과를 검증하였다. 또한 melatonin의 보호 효과를 glutamate 수용체 subtype의 각각의 길항제와 병용 투여하여 얻어진 흥분성 독성 억제 효과와 비교하였다. 본 실험에서는 항산화 효소인 Cu,Zn/Mn-SOD 활성의 변화와 반응성 산소 유리기에 의한 lipid peroxidation의 변화를 측정하여 반응성 산소기의 활성도의 지표로 삼았고, 선조체 신경활성의 척도로 사용되는 효소인 choline acetyltransferase (ChAT) 활성측정과 cresyl violet으로 뇌 단면의 <원문누락>