DNA 결손 방법에 의한 CYP1A의 Cis-element에 관한 연구

Abstract

In order to gain the insight into the role of cis-element for the regulation of cytochrome P450LA (CYP1A) by arylhydrocarbons, flavonoids and glucocorticoids, the deleted 5'-flanking DNA of CYP1A was cloned into CAT (chlorarnphenicol acetyltransferase) expression vector, Deleted mutants with Hind III or Sph I were transfected into Hepa-l cells, which were treated with 10^-(9) M 3MC or 10^(-6) M morin or 10^(-6) M dexamethasone or 10^(-9) M 3MC + 10^(-6) M morin for 24 hours, and morin was administered 12 hours prior to the addition of 3MC into the cells. Most of the deleted mutants resulted in the increase of the constitutive expression of CAT mRNA compared to that of wild type. 3MC did not increase the CAT mRNA of deleted mutants. pt Sl-CAT construct which is deleted at -1622∼+1 of trout CYP1A 5'-flanking DNA showed elevated level of constitutive expression, and didn't show the stimulation by 3MC. From these results, we suggest that -1622~+1 region of trout CYP1A 5'-flanking DNA is important for the negative regulation of the CYP1A gene expression and that intact CYP1A 5'-flanking DNA might be required for the regulation of CYP1A gene expression. To investigate the importance of orientation of DNA, deleted trout CYP1A 5'-flanking region was cloned into CAT expression vector in the right or reverse orientation. Reversely oriented deletion mutant did not show increased level of constitutive expression but show slight stimulation by 3MC. These results suggested that orientation is also important factor for the regulation of CYP1A gene expression.;Cytochrome P4501A (CYPIA) 5'-flanking DNA에 위치하는 cis-element의 작용 메카니즘을 조사하기 위하여 송어 CYPIA 5'-flanking DNA를 HindⅢ와 Sph Ⅰ 등의 제한 효소로 결손시킨 후, 이를 CAT (chloramphenicol acetyltransferase) expression vector의 promoter 앞에 연결하여 결손 변이체들을 제작하였다. 이 결손 변이체들을 Hepa-1 cell에 transfection하고 10^(-9) M 3MC, 10^(6) M dexamethasone, 10^(-6) M morin 등의 약물들을 처치한 후 변화되는 CAT mRNA를 RTPCR로 확인하였다. 그 결과, -1622∼+1 부위 결손체인 ptΔS1-CAT construct에서 CAT mRNA의 기초 발현 정도가 wild type에 비해 약 2.67배 증가함을 관찰했으며, 3MC에 의한 CAT mRNA 발현 증가는 관찰되지 않았다. -2498∼-1562 부위가 결손되고 바른 방향으로 연결된 ptΔH2a-CAT construct의 경우, CAT mRNA의 기초 발현 정도는 wild type에 비해 약 2.79배 증가되었으며, -2498∼-1562 부위가 결손되고 반대 방향으로 연결된 ptΔH2b-CAT construct의 경우에는 wild type에 비해 약 1.6배 정도의 CAT mRNA 기초 발현 증가가 관찰되었다. 대부분의 결손 변이체에서 dexamethasone의 처치로 CAT mRNA의 증가 작용을 관찰할 수 없었으며, morin의 단독 처리가 기초 발현을 감소시켰다. 또한 morin과 3MC를 병용 처치한 경우에도 모든 결손 변이체에서 3MC에 의한 유도 작용이 감소됨을 관찰하였다. 이로부터 송어 CYPIA 유전자 발현 조절에 있어서는 손상받지 않은 CYPIA 5'-flanking DNA 전체가 중요함을 알 수 있었다.