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산화적 스트레스에 의한 Apoptosis의 유발과 항산화효소, 항산화제 및 항암제와의 관계

산화적 스트레스에 의한 Apoptosis의 유발과 항산화효소, 항산화제 및 항암제와의 관계
Other Titles
Effects of antioxidant enzyme, antioxidant and anticancer drug on the induction of apoptosis by oxidative stress
Issue Date
대학원 약학과
산화적 스트레스Apoptosis항산화효소항산화제항암제
이화여자대학교 대학원
The induction of apoptosis by oxidative stress and the activity of antioxidant enzymes were investigated in HL60 cells treated with hydrogen peroxide (H_2O_2) Cisplatin known to generate oxygen species was added to cells and the induction of apoptosis and antioxidant enzyme activity were measured. The effects were compared with the results obtained from H_(2)O_(2) treated cells. After pretreatment with L-ascorbic acid, HL60 cells were exposed to H_(2)O_(2) to determine the effect of antioxidants on apoptosis. Also, H_(2)O_(2) and cisplatin was concomitantly treated and the changes in apoptosis and the activity of antioxidant enzyme were Investigated. Various concentrations of H_(2)O_(2) or cisplatin were treated to HL60 cells for different incubation times and the cells were harvested for assays. Cell viability, apoptotic morphology by propidium iodide staining and DNA fragmentation by agarose gel electrophoresis were observed to determine whether they induce apoptosis and to compare with each other. The activity of antioxidant enzymes such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) was also measured to evaluate the response of the cell to the oxidative injury. To determine the defense effect of antioxidants on apoptosis, the cells were pretreated with L-ascorbic acid, then exposed to H_(2)O_(2). The effect of anticancer drugs on cells exposed to free radicals was found by adding cisplatin to H_(2)O_(2)-treated HL60 cells. The experimental results showed the followings : H_(2)O_(2) induced apoptosis at 10 uM after incubation for 6hrs. On superoxide dismutase activity, the enzyme was induced at tolerable low concentration which showed no change of ceil viability, however, at concentration which caused apoptotic cell death enzyme level was dropped markedly at first and then returned to the normal level after which it declined again, probably due to apoptotic cell death, On the other hand, changes in the activity of catalase were not significant at any concentration or any time. In cisplatin-treated HL60 cells, the activity of SOD was increased at low concentration while it decreased at 10 uM, the concentration which induced apoptosis. Pretreatment of L-ascorbic acid defended the apoptotic cell death by oxidative stress. When treated with H_(2)O_(2) and cispiatin together, the viablility and SOD activity of HL60 were decreased at faster rate than those of cells treated with these drugs individually. In conclusions, the induction of apoptosis may be related to the level of SOD, but not catalase. H_(2)O_(2) and cisplatin-treated cells showed similar results in apoptotic response and enzyme activities, suggesting the possibility that anticancer activity of cisplatin may be related, at least in part, to the production of free radicals. And we found that the antioxidants molecules such as Vit.C can block the apoptosis induced by free radicals probably due to the expression of antioxidant enzyme such as SOD and catalase. Concomitant-administration of H_(2)O_(2) and cisplatin seemed to show additive effect by production of free radicals.;산화적 스트레스에 의한 apoptosis의 유발과 이에 대응하는 항산화효소 활성과의 관계를 알아보기 위하여 human promyelocytic leukemia cell line인 HL60 세포에 산화제 -hydrogen peroxide (H_(2)O_(2))와 항암제 -cisplatin을 각각 단독 투여하였고, 이때 항산화제가 미치는 영향을 살펴보고자 H_(2)O_(2)에 L-ascorbic acid를 병용 투여하였으며 또, H_(2)O_(2) 처리 후 cisplatin을 투여함으로써 항암제의 병용 투여에 의한 apoptosis의 유발과 항산화 효소 활성의 변화를 관찰하였다. 즉, HL60 세포에 H_(2)O_(2)를 농도별 및 시간별로 처리하여 cell viability와 propidium iodide staining에 의한 morphology 및 agarose gel electrophoresis에 의한 DNA fragmentation을 관찰함으로써 apoptosis의 유발을 확인하였고, superoxide dismutase (SOD)와 catalase (CAT)의 활성을 측정하여 항산화효소의 변화를 조사하였다. 한편, L-ascorbic acid를 전처리한 후 H_(2)O_(2)를 투여하였을 때의 생존율과 항산화효소 활성의 변화를 관찰하였다. 또, free radicals를 발생시킨다고 알려진 cisplatin을 농도별, 시간별로 투여하여 apoptosis가 일어남을 확인하였으며, 이 때 SOD와 CAT의 활성을 조사하여 그 관련성을 알아보았다. 끝으로, H_(2)O_(2)를 처리한 후 다시 cisplatin을 투여하여 생존율의 변화와 항산화효소 활성의 변화를 관찰하여 단독 투여의 경우와 비교하였다. 그 결과, H_(2)O_(2) 단독 투여시 저농도에서는 생존율의 변화없이 SOD의 활성이 증가되었고, 10 μM에서는 6시간 이후 생존율의 감소와 DNA fragmentation을 일으켰으며, 이 때 SOD의 활성이 감소한 반면, CAT은 어느 농도나 시간에서도 별 변화를 보이지 않았다. 또, L-ascorbic acid를 전처리한 후 H_(2)O_(2)를 투여하였을 때 생존율이 증가되었고, catalase와 SOD 모두 증가하였다. Cisplatin도 HL60 cells에서 생존율에 변화가 없는 저농도에서는 SOD의 활성이 증가된 반면, 10 μM에서는 12시간 이후 apoptosis를 일으켰으며 동시에 SOD의 활성이 감소하였고, CAT는 아무런 변화가 없었다. H_(2)O_(2) 처리 후 cisplatin을 투여하였을 경우에는 각각의 단독 투여시와 비교해 더욱 큰 생존율의 감소와 SOD 활성의 감소가 나타났다. HL60 세포에 H_(2)O_(2)를 처리하였을 때, 저농도에서는 SOD의 유도에 의한 방어 작용이 나타났으며 10 μM에서는 apoptosis가 일어남과 동시에 효소 활성이 감소됨을 보았다. Cisplatin을 처리하였을 경우에도 H_(2)O_(2) 투여시와 마찬가지로 저농도에서 SOD 활성 증가에 의해 방어되고 10 μM에서 apoptosis 유발시 SOD의 활성이 감소된 점으로 보아 cisplatin이 세포 내에서 free radicals를 발생시키며, 이에 의해 apoptosis를 일으킬 수 있슴을 확인하였다. L-ascorbic acid의 전처리에 의해 생존율이 증가한 것으로 보아 항산화제가 apoptosis를 억제한다는 것과 이것이 항산화효소 유도에 의한 것일 수 있다는 사실을 보여주며, H_(2)O_(2)와 cisplatin을 병용 투여하였을 때에는 부가 작용에 의해 apoptosis의 유도와 항산화효소의 감소를 나타낸 것으로 추측된다. 이 실험 결과에 의해, free radicals에 의해 유발되는 apoptosis에는 superoxide dismutase가 관계되고 catalase와는 아무런 관련이 없으며, 항산화제는 이에 대해 방어 효과를 가진다는 결론을 얻었고, cisplatin은 H_(2)O_(2)와 같이 free radicals 발생에 의해 apoptosis를 일으키며 H_(2)O_(2)와 부가 작용을 한다는 사실을 알 수 있었다.
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일반대학원 > 생명·약학부 > Theses_Master
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