Aureobacterium sp. YL의 분리 동정 및 chitosanase 특성에 관한 연구

Abstract

Chitosan은 지구상에 cellulose 다음으로 흔하게 존재하는 chitin을 탈아세틸화 시켜서 얻을 수 있는 물질로 chitosan 자체로도 여러가지 생리활성 작용이 보고되고 있지만, chitosan을 분해해서 얻을 수 있는 chitosan oligomer는 항암 활성이나 면역 활성 작용등이 강한 것으로 알려져 있고 현재도 연구가 진행되고 있다. 본 연구에서는 chitasanase를 생성하는 균주를 게껍질 시료에서 순수 분리, 동정하여 Aureobacterium sp. YL이라 명명하였다. 본 균주의 chitosanase의 생성조건을 조사하였고, 효소를 분리, 정제하여 효소의 특성을 조사하였다. 효소의 최적 생성조건은 pH 7.0과 배양온도 30℃였다. 이 균주는 chitosan이 유일한 탄소원으로 공급되었을 때만 chitosanase를 생성하였다. 배지중 질소원은 tryptone과 casitone을 같이 넣어 주었을 때 효소의 생성이 많은 것으로 나타났다. 효소 분리를 위하여 본 균주의 배양액을 50∼90% ammonium sulfate 침전 분획을 얻어 DEAE-cellulose column chromatography를 실시한 결과 두개의 활성 분획을 얻었다(chitosanase I, II). chitosanase I은 DEAE-cellulose, Octyl-sepharose column, II는 1차 DEAE-sepharose, Octyl-sepharose, 2차 DEAE-sepharose column chromatography를 통해서 분리하였다. 각각의 분자량은 SDS-PAGE에서 chitosanase I과 II가 각각 62,100, 34,400으로 밝혀졌고, 각각의 비활성은 50.3U/mg, 90.8U/mg으로 이제까지 밝혀진 Nocardioides sp., Bacillus R-4, Pseudomonas sp. H-l4등의 chitosanase에 비해 효소의 비활성이 높은 것으로 조사되었다. 분리된 chitosanase I과 II는 특히 chitosan에 대해 분해활성이 월등히 높았으며 glycol chitosan이나 N-trialkyl chitosan에 대해서도 분해활성이 있었지만 colloidal chitin이나 CM-celluolse에 대해서는 분해 능력이 없었다. 분리된 효소의 최적 반응온도와 pH는 50℃와 pH 5-7이었다. 그리고, 분리된 효소는 각각 pH 5-8, 5-7 사이에서, 30-40℃까지는 안정하였으며, I의 경우 Li^(+), Ca^(2+), Mg^(2+)를 넣어서 반응시켰을 때 더 좋은 활성을 나타내었으며, II의 경우 Ca^(2+), Mg^(2+)를 넣었을 때 활성이 다소 증가 되었다.;Aureobacterium sp. YL, a bacterial strain capable of hydrolyzing chitosan, was isolated from crab shell samples, by selective enrichment culture. This chitosanases were induced by chitosan as a carbon source, and the microorganism used tryptone and casitone as a nitrogen source. This strain produced two extracellular chitosanases induced by chitosan. Maximum production of enzymes were observed at pH 7.0 and 30℃. The enzyme proteins were purified by ammonium sulfate 50-90 % fractionation, DEAE-cellulose, Octyl-sepharose column chromatography for chitosanase Ⅰ, and first DEAE-sepharose, Octyl-sepharose, second DEAE-sepharose column chromatography for chitosanase Ⅱ. Chitosanase Ⅰ and Ⅱ had molecular weight of 62,100 (62.1kDa) and 34,400 (34.4kDa) determined by 10% SDS-PAGE, and specific activities were 50.3U/㎎ and 90.81U/㎎, respectively. The enzymes showed activities on chitosan, N-trialkyl chitosan and glycol chitosan, no activity on colloidal chitin, and CM-cellulose. The optimal activity of its chitosanase was 50℃ and pH5.0-7.0. Chitosanase Ⅰ and Ⅱ were stabilized at pH5-8, 5-7 and below 30 -4O℃. The Ca^(2+) and Mg^(2+) metal ion enhanced enzyme activity.