LPS에 의한 대뇌피질 Microglia 활성화 시에 발현되는 outward K^+ channels의 기능에 관한 연구

Abstract

Microglia는 뇌 손상시에 손상 부위로 이동하여 활성화되고 세포 증식과 식작용을 하며 nitric oxide(NO)와 cytokine을 분비하는 등 면역세포로서의 기능을 담당하게 된다. 그러나 이러한 기능의 활성화가 어떤 기전에 의해 일어나는 가에 대하여는 잘 알려져 있지 않다. 최근 들어 많은 연구들이 microglia가 활성화될 때 outward K^(+) channels이 발현된고 보고하였다. 이러한 outward K^(+) channels은 lymphocyte와 지방세포에서 세포 증식과 관계가 있고 mast cell에서는 세포 분화와 관계 있다는 것이 알려져 있다. 본 연구에서는 microglia 활성화 시에 나타나는 outward K^(+) channels이 microglia 활성화에 관여하는지를 조사하기 위하여 microglia 활성화시에 나타나는 현상인 outward K^(+) channels 증가와 세포형태의 변화, 세포 증식, 식작용, NO 생성을 동정하였다. 쥐의 대뇌 피질로 부터 microglia를 배양하고 2-3주 후 bacterial endotoxin인 lipopolysaccharide(LPS)로 활성화시켰다. LPB로 이틀 처리하여 활성화시킨 microglia는 첫째, voltage-gated K^(+) channels의 하나인 Kv1.5에 대한 항체로 면역염색하였을 때 resting 상태의 ameboid microglia에서 낮게 발현되었던 outward K^(+) channels의 발현이 증가하였고, 둘째, 형태에 있어서 resting 상태의 작고 둥근 모양 또는 나뭇가지 모양에서 세포체가 크고 넙적한 모양으로 변화되었고, 셋째, 세포 증식에 있어서 resting 상태의 둥근 모양의 ameboid microglia에서 일어나는 세포 증식이 LPS에 의해 감소되었고, 넷째, 식작용에서는 resting 상태에 비해 LPS로 활성화되었을 때 식작용이 증가하지만 세포체가 매우 넓어진 경우에서는 다시 감소 하였고, 다섯째, NO 생성은 96시간 까지 계속 증가하였다. Microglia 활성화에서 K^(+) channels의 기능을 조사하기 위하여 K^(+) channel억제제와 LPS를 함께 처리하고, 활성화 시에 나타나는 변화가 어떻게 영향을 받는가를 관찰하였다. K^(+) channel 억제제들 중 outward K^(+) channels에 대한 특이성이 큰 4-aminopyridine(4-AP)는 첫째, 형태 변화에서는 LPS에 의한 모양 변화를 억제하였으며, 둘째, 세포 증식에 있어서 LPS에 의해 감소 되는 변화를 회복시키지 못하였으며 4-AP를 단독으로 처리하였을 때에도 아무런 변화가 없었다. 셋째, 식작용은 4-AP로 억제되지 않았으며, 넷째, NO 생성은 LPS로 활성화되었을 때 계속적인 증가를 보였으나 4-AP로 50% 이하로 억제되었다. 반면에 outward K^(+) channels 억제 효과가 적은 TEA는 LPS에 의해 유도되는 형태 변화, NO 생성을 억제하지 못 하였다. 이러한 결과들은 outward K^(+) channels이 세포 증식과 식작용에는 영향이 없으나 모양 변화와 NO 생성으로 나타나는 microglia의 면역세포로의 분화 과정에 필요하다는 것을 의미한다. 그러나 4-AP가 이미 활성화된 microglia의 모양 변화를 원 상태로 되돌리거나 활성화된 세포로 부터 생성되는 NO를 억제하지 못한다는 것은 outward K^(+) channels이 활성화 상태의 유지나 NO 생성에 필요한 기작 자체에 작용하기 보다는 활성화 과정의 어떤 부분에 작용할 가능성을 의미한다.;Microglia, brain's immune cells, are activated by brain injury and migrate around injured areas and play roles of imumune cells such as proliferation, phagocytosis, and secretion of nitric oxide(NO) and cytolkines. However, tile exact mechanism of the activation of microglia remains to be delineated. Recently, the evidences have reported that the expression of outward K^(+) channels is increased during the microglial activation, Many group reported that the proliferation of lymphocytes and brawn fat and differentiation of mast cells were related with outward K^(+) channels. To study whether that outward K^(+) channels are interrelated with activated microglial functions or not, we measured expression of outward K+ channels, morphological changes, proliferation, phagocytosis and NO release during the activation of microglia. We prepared microglia from the neonatal rat brains, cultured for two or three weeks. Lipopolysaccharide(LPS), a bacterial endotoxin, was treated to activate microglia. Microglia which were exposed to LPS for 2 days showed (1) marked expression of K^(+)channels revealed by immunohistochemistry using polyclonal antibodies to Kvl. 5, one of voltage-gated K^(+) channels, which in resting states ameboid microglia stained lightly, (2) underwent some morphological changes from small and/or ramified cell bodies in resting states to large and flat ones, (3) ameboid microglia which can proliferate in resting states lost mitotic activity, and (4) increased the phagocytosis of beads in the middle of activation and then reduced. To study the function of K^(+) channels expressed in activation of microglia, microglia were treated with LPS in the presence of 4-aminopyridine(4-AP) which blocks up to 90% of the outward K^(+) channels. 4-AP (1) inhibited LPS-induced morphological changes and (2) reduced NO secretion at activated microglia, (3) had no effeet of proliferation and (4) not inhibited phagocytosis. However, tetraethylammonium (TEA) which has less effect on outward K^(+) channels did not block NO release. These results imply that the LPS-induced expression of outward K^(+) channels are required for microglial differentiation particularly morphological changes and NO secretion. However the fact that 4-AP did not prevent LPS-pretreated microglial morphological changes and NO release implies that outward K^(+) channels do not affect the maintenance of activation and NO release but may affect certain part of the activation precess.