Nano-based polymeric biomaterials for tissue regenerative therapy

Abstract

조직재생기술을 이용하여 치료 수복된 새로운 조직이 정상적인 형태와 기능을 갖도록 하기위하여 삼차원 지지체와 세포를 이용한 조직공학 기술의 이용이 필수적이다. 여기서 삼차원 지지체는 부착세포와 새로 재생된 생체 조직의 구조적 기반을 제공한다. 이상적인 지지체는 생체 세포외기질의 구조적, 생리학적 모방체이며 이는 재생을 위한 공간을 확보하고 생리활성을 부여하여 조직재생을 극대화 할 수 있다. 본 논문에서는 재료, 형태의 복합 기술과 나노테크놀로지를 이용하여 물리적으로 안정하고 생체 적합성이 뛰어난 생체모방형 삼차원 지지체를 제조하고 이의 물리적 특성과 생리활성을 평가하였다. 또한 재생능 확대를 위한 최적의 지지체를 제조하기 위하여 생체재료의 표면 성질 및 물성과 세포와의 상호작용에 관한 기초 연구를 수행하였다. 특히 나노 형태와 생체모방구조에 의한 조직재생능의 시너지 효과를 확립하여 이를 기반으로 한 삼차원지지체를 제조 평가하는데 목적을 두었다. 연구는 크게 다섯개로 대분류 될 수 있다. 1) 혼합 공통용매를 이용하여 용액 방사법으로 균일한 키토산과 PLGA 혼합 섬유를 제조하여 지지체의 생체적합성 및 물성을 증진하였다. 이를 이용한 삼차원 섬유형 지지체는 조직재생능이 뛰어나고 구조적으로 안정한 형태를 유지할 수 있음을 확인하였으며 본 연구는 천연고분자와 합성고분자의 균일한 혼합방법과 섬유형 지지체의 새로운 제조방법 및 이용에 관한 starting point 로서의 의의를 갖는다. 2) 두번째로는 조직재생유도술을 위한 키토산 나노 섬유를 전기방사법으로 제조하였다. 두 유기용매 hexafluoroisopropanol 과 methylene chloride의 극성과 휘발성을 조절하여 키토산의 용해 및 방사가 가능하였다. 높은 표면적과 공극률을 갖으며 세포 부착 표면에 삼차원 구조를 제공하여 세포의 부착 증식이 뛰어나며 조직 친화력이 뛰어난 지지체를 제공하였다. 3) 나노섬유 적층에 의해 형성되는 지지체가 갖는 공극 크기 조절의의 한계와 삼차원 구조를 형성하기엔 미약한 강도를 마이크로 섬유의 혼합으로 보강하여 물리적 안정성을 갖는 삼차원 구조지지체를 제조할 수 있었다. 미리 제조된 마이크로 섬유위에 나노섬유를 전기방사하여 두층의 지지체를 제조하였으며 이 지지체를 적층하거나 마는 형태로서 적정 두께와 높이를 갖는 지지체가 형성되었다. 이 지지체는 세포가 내부까지 이동하여 자라기에 충분한 공극을 갖고있으며 나노 섬유로인하여 부착, 증식이 확연히 증가되어 뛰어난 조직재생능을 갖고있음이 확인 되었다. 또한 나노섬유로 인한 세포의 부착, 증식, 분화의 영향을 확인하기 위한 연구를 동시에 진행하여 나노표면이 조직 재생에 필수적임을 확인하였다. 4) 생체모방구조를 재현하기 위하여 콜라겐 나노 섬유를 제조하였다. 콜라겐에 의한 구조적 불안정과 가교과정의 세포독성을 해결하여 결정성을 갖는 합성고분자인 PLLA를 혼한 방사하여 나노섬유로 제조 이용하였으며, 콜라겐에 의한 세포활성 비교 및 물성 평가를 통하여 콜라겐 혼합 나노섬유의 적정 비율 및 안정적 형태를 확립하였다. 5) 조직 재생을 위한 생체모방 삼차구조를 갖는 콜라겐-PLLA 나노 섬유와 키토산 마이크로 섬유의 혼합 지지체를 제조하였다. 대부분의 세포가 초기에 나노섬유에 부착 집합되어 자라며 서로 영향을 주어 마이크로 섬유로 이동 여러겹의 구형을 유지하며 증식되어 일정기간후에는 연골 조직을 형성하는 것이 관찰되었으며 이때 나노섬유의 밀도, 거리등이 조직 재생능에 영향을 주는것을 확인하였다. 또한 콜라겐-PLLA 나노섬유를 혼합한 지지체에서 가장 높은 효율의 조직 재생능을 확인 할 수있었으며 이는 나노 구조 및 생체모방 구성성분에 의한 것이다. 이러한 삼차원지지체는 조직 재생을 위한 맞춤형 지지체로 응용 될 수 있을 것이다. 이 연구는 조직 재생능 향상을 위한 나노구조를 기반으로 한 생체모방형 지지체의 새로운 제조 방법을 제시하고 이의 응용가능성을 제안하였다. 나노 생체재료의 물성, 조직친화력, 재생능에 관한 연구를 통하여 최적의 조건 확립 및 기능을 평가 하였으며 더불어 나노구조와 세포간의 커뮤니케이션에 관한 메카니즘 연구를 진행하였다. 나노구조의 메카니즘 연구를 통하여 생리활성 고분자를 이용한 나노 생체재료는 뼈나 연골 조직재생 치료 효과 증대시킬 수 있을 것으로 사료되었다. 그러나 현재 나노를 기반으로한 생체재료의 연구가 대부분 이차원 표면 처리에 머물러 있는 점에서 본 연구는 나노 섬유를 마이크로 섬유와 복합체를 제조하여 삼차원 지지체에 활용 가능성을 제시하고 이를 이용한 조직 재생능 평가 연구를 통하여 본 고분자 생체재료가 조직공학용 재료로서 뛰어난 효과를 보임을 확인하였다.;Tissue engineering approach for functional tissue repair involves 3-dimensional scaffolds that provide the structural bases to adhered cells and synthesized matrix molecules. Ideally, a scaffolding candidate should mimic the structure and biological function of native extracellular matrix proteins, which provide mechanical support and regulate cellular activities. In order to improve the biocompatibility, biostability and effective regeneraion of 3-D scaffold was composition of synthetic and natural polymers and nanotechnology, respectively. The surface and bulky properties of the modified scaffold were characterized and their interactions and efficient at tissue regeneration were investigated. In particular, the synergistic effect of nano-architecture and biomimetic materials on tissue regeneration was further studied. Fabrication and evaluation of developed scaffolds were described according to the result of these studies. This research is divided into five categories. First, a homogeneous composite fibrous scaffold of synthetic and natural polymers was developed to improve physical and biological properties. Second, fabrication of the nanofibrous fabrics with chitosan was investigated for guided tissue regeneration. Third, the nanofibers were applied to three-dimensional applications. Forth, the effect of nanofibers on 2-D and 3-D matrices of chondrocytes were evaluated. Fifth, analog of natural ECM were achieved by collagen/PLLA nanofibers and chitosan microfibers scaffolds. The research presented in this dissertation is very significant with regard to the following observations: 1) In order to improve the biocompatibility of scaffold, 3-dimensional fibrous scaffold with homogeneous composition of chitosan and PLLA was accomplished by wet spinning using co-solvent. The novel porous fibrous chitosan/PLGA hybrid matrices investigated in this study will be a starting point for the future development of synthetic and natual based scaffolds for tissue regeneration. 2) Chitosan membranes with continuous nanofibers were prepared by electrospinning for effective guided tissue regeneration as the barrier membranes. By regulating dielectric constant of HFIP/MC, chitosan can be dissolved and electrostatic spinning. Because of the inherently high aspect ratio and specific surface area, electrospun nanofibers are potentially useful for a variety of applications. 3) 3-D nano- and micro- composite fibrous scaffold were prepared as biomimetic exogenous artificial matrix by combined two techniques of highly porous microfibrous matrix and nanofibrous network architecture which the micro fibrous matrix served as a skeleton reinforcing the composite scaffold and the chitosan nanofibrous network facilitated cell seeding, cell distribution, and tissue formation. Chondrocytes response to nano-based architecture and in vivo applications of these scaffolds need further investigations. 4) To study the impact of nano topographical signals on chondrocytes behavior, quantitative and qualitative analysis were performed. On dense nanofibrous surfaces, cells migrated onto and preferentially attached to, and maintained spherical morphology, Rarely F-actin rearrangement and evidently type II collagen expression which means phenotype maintenance of chondrocytes. 5) The 3-D fibrillar network structure of collagen/PLLA provided mechanical and physical support and biological functions. In vitro chondrocytes culture suggests that cells in collagen/PLLA nano composites matrix preferentially attached and formed newly cartilaginous matrix. The cells in the nanofibers formed aggregated and were connect to each other. Also by adjusting the density of nanofiber sheets and thickness of microfiber sheets, physical stability and cytocompatibility were controlled. With the ability to control nano- and micro- architecture and composition, Synthetic analogues of natural extracellular matrices combine the advantages of architecture of the natural extracellular matrices and synthetic biodegradable polymers have the great potential to be tailored into ideal scaffold for tissue regeneration. Therefore, this studies suggest the feasibility of nano-based polymeric biomaterials for tissue regenerative therapy.