Anticancer and cancer chemopreventive potential of alantolactone and antofine derived from natural products

Abstract

Many epidermiological studies suggest that with the increase of the extrinsic or intrinsic factors in carcinogenesis, the incidence and mortality of cancer also tend to be increased progressively. Therefore, it should be necessary to develop effective strategies for treatment and control of cancer. In this respect, this study was performed to evaluate anticancer and cancer chemopreventive potential of bioactive constituents derived from natural products and also examine their mechanisms of action. In the chapter one, the background and purpose of this study were explained. In detail, current status of anticancer agents, the definition and significance of cancer chemopreventive agents, the importance of natural products on drug development, and, finally, the purpose of this study were briefly described. In the chapter two, the cancer chemopreventive potential of a naturally occurring sesquiterpenoid alantolactone were investigated. Cancer chemoprevention is defined as the use of bioactive compounds derived from natural products or synthesis molecules to reverse, retard, and prevent the process of carcinogenesis. Carcinogenesis is a complex, multi-step process which progress for over ten years, and it may be difficult to cure malignant tumors completely. In this respect, chemoprevention might be a novel strategy to control and, ultimately, overcome cancer. In this study, chemopreventive potential of alantolactone derived from the root of Aristolochia debilis (Aristolochiaceae) was evaluated using in vitro experimental systems. First of all, the effect of alantolactone on the expression of a phase II detoxification enzyme which acts on reactive metabolites and converts them to polar, non-reactive ones was examined. Alantolactone dose-dependently induced the activity of quinone reductase (QR) in Hepa 1c1c7 cells. Treatment of alantolactone also increased QR mRNA expression through the increase of Nrf2 translocation, suggesting that up-regulation of QR activity through Nrf2 might be related to the induction of QR expression. Next, the anti-promotional effect of alantolactone with respect to tumor promoter-induced cell transformation as well as the regulation of cancer cell proliferation was determined. Alantolactone suppressed tumor promoter-induced transformation of JB6 mouse epidermal cells in a soft agar colony formation assay. The mechanisms underlying inhibition of cell transformation by alantolactone might be the inhibition of phorbol ester-induced extracellular signal-regulated kinase (ERK) and signal transducer and activator of transcription-3 (STAT3) activation. In addition, alantolactone inhibited the proliferation of several human cancer cells. Alantolactone possessed anti-proliferative effect against HCT 116 human colon cancer cells with induction of G2/M phase cell cycle arrest and subsequent cell death. G2/M phase cell cycle arrest by alantolactone might be occurred between prometaphase and anaphase in the mitosis. The induction of cell death by alantolactone was also associated with the induction of apoptosis, which was demonstrated by increase of condensed or fragmented DNA in the nucleus, annexin V-positive cell population, poly(ADP-ribose) polymerase cleavage, and expression of apoptosis-related proteins such as Bax and NAG-1, and activation of caspases. Furthermore, co-treatment with N-acetyl-L-cysteine (NAC) abrogated reactive oxygen species (ROS) increase and anti-proliferative activity of alantolactone, indicating that one of mechanisms underlying alantolactone-mediated growth inhibition might be the increase of ROS generation. Alanolactone also activated stress-mediated signaling, including the increase of JNK and p38 phosphorylation, and heat shock protein induction. The treatment of alantolactone induced the decrease of phosphorylated focal adhesion kinase (FAK), suggesting possible involvement of anoikis in the alantolactone-mediated cell death. Taken together, these results might provide possible mechanisms of alantolactone on the regulation of carcinogenesis, and also suggest its potential as a candidate for developing cancer chemopreventive agents from natural products. In the chapter three, the anticancer potential of a natural phenanthroindolizidine alkaloid antofine derived from Cynanchum paniculatum (Asclepiadaceae) was studied. Natural products have served as an important source for developing novel therapeutic agents. On the anticancer therapy, plant-derived principles such as paclitaxel, vinblastine, and camptothecin, play important roles as potent therapeutic agents and good lead compounds for the development of more effective drugs. Thus, it may be valuable to discover novel active principles from natural products and elucidate their mechanisms of action. According to this, anticancer potential of antofine was primarily evaluated, and the anti-proliferative mechanisms of action were further investigated. In addition, the structure-activity relationships with various antofine analogues on the proliferation of human cancer cells were also examined. Antofine exhibited potent anti-proliferative effects against several human cancer cells with the EC50 values ranging 6 to 30 nM. In HCT 116 human colon cancer cells, antofine showed the most potent growth-inhibitory effect among tested human cancer cells. Cell cycle analysis showed that antofine neither induced apoptotic cell death nor markedly arrested any specific phases of the cell cycle. Western blot analysis demonstrated that antofine moderately inhibited the expression of cyclin D1, cyclin E, and cdk4 expression in a concentration-dependent manner. In addition, antofine dose-dependently suppressed DNA synthesis, and the expression level of beta-catenin and cyclin D1 were also reduced by treatment with antofine, indicating possible involvement of modulation of Wnt signaling in the regulation of cell proliferation by antofine. Taken together, these findings suggest that antofine might be a novel candidate for developing cancer chemotherapeutic agents derived from natural products.;암은 전세계적으로 가장 큰 사망 원인이 되는 질환 중의 하나로서, 여러 보고에 따르면 환경 오염의 악화, 스트레스의 증가, 고지방 식이의 증가, 평균 수명의 증가 등 암을 유발할 수 있는 내, 외부적 요인이 증가함에 따라 암의 발생률 및 그로 인한 사망률이 증가하는 추세에 있는 것으로 알려지고 있다. 또한 암의 발생 및 그의 치료로 소요되는 경제적, 사회적 부담 또한 증가되는 추세에 있어, 이미 생성된 암을 선택적으로 제거하거나 화학 물질을 이용하여 암의 진행을 막는 등, 암을 제어할 수 있는 효과적인 방안의 마련이 필수적이라고 할 수 있다. 이러한 배경에 따라, 본 연구에서는 천연물 유래 물질들의 항암 및 암예방 효능 물질로서의 가치를 평가하고 그 작용기전을 연구하였다. 우선, 본 연구에서는 천연물에서 유래한 sesquiterpenoid류인 alantolactone의 화학적 암예방제로서의 가능성을 확인해 보고자 하였다. 본 연구에서는 alantolactone의 암예방제로서의 가능성을 여러 in vitro 실험 모델을 이용하여 평가하였으며, 더불어 각 활성에 대한 작용기전 연구를 실시하였다. 우선, 반응성 있는 대사체의 체외 배설을 돕는 phase II enzyme 유도 활성을 평가한 결과, alantolactone은 phase II enzyme의 일종인 quinone reductase (QR)의 활성을 농도 의존적으로 증가시켰다. 이러한 활성은 QR의 발현을 조절하는 transcription factor인 Nrf2의 핵 내로의 이동을 통하여 QR의 mRNA 발현이 증가하는 것을 통하여 이루어지는 것으로 여겨진다. 다음, alantolactone은 tumor promoter가 유도하는 mouse epidermal cell line인 JB6 세포의 transformation을 억제하는 효능을 보였다. 이러한 활성은 tumor promoter에 의하여 활성화되는 extracellular signal-regulated kinase (ERK) 및 signal transducer and activator of transcription-3 (STAT3)의 활성화를 농도 의존적으로 억제하기 때문으로 여겨진다. 또한, alantolactone은 여러 사람 암세포주의 증식을 농도 의존적으로 저해하는 효과를 나타내었다. HCT 116 세포를 이용한 작용기전 연구 결과, alantolactone은 HCT 116 세포에 대하여 G2/M phase cell cycle arrest를 유도하였으며 처리하는 농도가 증가하면 세포 사멸도 유도하는 것으로 확인되었다. Alantolactone의 G2/M phase arrest 작용은 mitosis 과정 중 prometaphase와 anaphase 사이를 조절하는 것에 기인하며, alantolactone의 세포 사멸 유도 작용은 DAPI staining에서 condensed DNA 및 fragmented DNA가 확인되었고 alantolactone에 의하여 annexin V-FITC에 염색된 세포의 수가 증가하였으며 poly(ADP-ribose) polymerase의 cleavage를 유도하고 Bax와 NAG-1과 같은 proapoptotic protein의 발현을 증가시키는 것, 그리고 alantolactone에 의하여 caspase류가 활성화되는 것 등을 통하여 볼 때 apoptosis 유도와 밀접한 관련이 있는 것으로 여겨진다. 이와 더불어, 항산화제인 N-acetyl-L-cysteine을 동시에 처리하면 alantolactone의 세포 증식 저해 및 사멸 유도 작용이 뚜렷하게 억제되며, stress에 의하여 활성화되는 세포신호 전달체계인 JNK 및 p38이 alantolactone에 의하여 활성화되었고 세포 내 stress에 의하여 유도되는 heat shock protein의 발현이 증가되는 점, 그리고 alantolacotone에 의하여 focal adhesion kinase의 phosphorylation이 억제된 점 등을 통하여 볼 때, alantolactone의 암세포 증식 작용에는 세포 내 oxidative stress 증가에 따른 stress-mediated signaling의 활성화 및 anoikis 유도도 연관이 있는 것으로 추정된다. 다음, 본 연구에서는 산해박 (Cynanchum paniculatum)에서 유래된 phenanthroindolizidine계 alkaloid인 antofine의 암세포 증식 저해 활성을 평가하고 그 작용기전을 연구하였다. Antofine은 기원을 달리하는 여러 사람 암세포주의 증식을 강력하게 저해하는 효능을 나타내었다. 그러나 일반적인 항암 효능 물질과는 달리, antofine은 세포 사멸을 유도하지 않았으며, 세포 주기 조절에 있어서도 특정 세포 주기에서의 세포 주기 진행을 억제하는 효능을 보이지도 못하였다. 따라서 antofine의 작용기전은 세포 주기 진행 조절 및 사멸 유도가 아닌 다른 작용기전이 관여할 것으로 추정되며, 본 연구 결과 antofine은 DNA 합성을 저해하였고 대장암 세포의 암화에 관여하는 신호전달 체계인 Wnt signaling의 활성화를 저해하는 효능을 나타내었다. 또한 microarray를 이용한 유전자 발현 분석 결과를 통하여 볼 때 mitochondria의 활성 조절 및 ubiquitin-proteasome pathway의 활성화 조절 등도 antofine의 암세포 증식 저해 작용에 관여할 것으로 추정된다. 이와 더불어, antofine의 작용기전을 나타내는 데 관여하는 구조-활성 관계를 명확하게 하기 위하여 여러 antofine 유도체에서 대한 암세포 증식 저해 활성 평가를 실시하여 구조-활성 관계를 확인하였다. 지금까지의 결과를 종합하면, 천연물에서 유래한 alantolactone 및 antofine인 암예방 또는 항암 효능을 지니는 것으로 여겨지며, 이들은 천연물로부터 새로운 항암 및 암예방 효능 물질 개발을 위한 선도 물질로서 가치가 있을 것으로 전망된다.