Involvement of phosphatidyl inositol 3-kinase/Akt and poly(ADP-ribose)polymerase-1 in regulation of muscarinic receptor-mediated sAPPalpha release

Abstract

The amyloid precursor protein (APP) is a transmembrane protein that produces βA4 amyloid peptide, found in the brains of Alzheimer's disease (AD). APP normally undergoes proteolytic cleavage within the Aβ sequence by α-secretase, liberating a soluble N-terminal fragment (sAPPα) which can promote neuronal cell survival. G_(q/11) protein-coupled muscarinic receptors are known to regulate the release of sAPPα produced by α-secretase processing, however, its regulation mechanisms remain to be further elucidated. We recently reported that the nuclear factor NF-κB eB activated by capacitative Ca^(2+) entry (CCE) enhances release of sAPPα induced by muscarinic receptor activation in SH-SY5Y neuroblastoma cells (Choi et al., 2006). It has been shown that G-protein-coupled receptors (GPCRs) link to phosphatidyl inositol (PI) 3-kinase /Akt pathway which can lead to the NF-κB activation. In this thesis, whether PI3-kinase/Akt pathway plays a role in muscarinic receptor-mediated sAPPα release enhancement and contributes to a changed CCE was investigated. The CCE generation and sAPPα release induced by muscarinic receptor stimulation with an agonist, oxotremorin M (oxoM) was inhibited by pretreatment with PI3-kinase inhibitors, wortmannin or LY294002, or by transfection of p85 regulatory subuint of PI3-kinase construct, indicating that PI3-kinase pathway is involved in muscarinic receptor-mediated sAPPα release. To determine the involvement of Akt activity which is known to be closely related to PI3-kinase in the regulation of muscarinic receptor-mediated sAPPα release, whether muscarinic receptor-stimulation changes Akt activity was first examined. It was found that muscarinic receptor-stimulation negatively regulates Akt activity in SH-SY5Y cells. To test whether the change in Akt activity can alter the muscarinic receptor-mediated Ca2+ influx and sAPPα release, two known Akt inhibtors, Akt inhibitor Ⅷ and SH-6, were used. Akt inhibitor Ⅷ showed an inhibitory effect on Akt phosphorylation and abolished all the muscarinic receptor-mediated Ca^(2+) currents and sAPPα release in concentration-dependent manners. SH-6, however, failed to produce its inhibitory effect in experimental condition and showed no significant change in Ca^(2+) current and sAPPα release. Next to further confirm the involvement of Akt in muscarinic receptor-mediated Ca^(2+) influx and sAPPα release, SH-SY5Y cells were transiently transfected with wild-type (wt) Akt or Akt mutant constructs. In wtAkt Vtransfected cells, phospho- and total Akt expression levels were increased but the significant muscarinic receptor-mediated change in Akt phosphorylation was not observed. In cells transfected with dominant negative Akt mutant K179M, basal Akt phosphorylation level was not decreased. On the other hand, the basal Akt phosphorylation level and inhibitory effect of muscarinic agonist on Akt phosphorylation was reduced in cells transfected with an Akt R25C. Comparatively to these results, changes of muscarinic receptor-mediated CCE response and sAPPα relese were not observed in wtAkt or K179M transfected cell, whereas a marked reduction of the sAPPα release enhanced by muacarinic receptor-activation was observed in R25C transfected cell. These results indicate that the pleckstrin homology (PH) domain of Akt, the binding site of PIP3, which is known to play important role on Akt phosphorylation, may regulate muscarinic receptor-mediated sAPPα release. Another purpose of this study was to investigate the involvement of poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1), a new nuclear target for signal transduction, in muscarinic receptor-mediated sAPPα release. Three different PARP-1 inhibitors, 3-aminobenzamide, PJ-34 or nicotinamide, inhibited the muscarinic receptor-mediated sAPPα release, although the oxoM-induced CCE stimulation was not affected by pretreatment of one of PARP-1 inhibitors, PJ34. These results suggest the involvement of PARP-1 activity in muscarinic receptor-mediated sAPPα release. Further experiments are required to determine the precise role of PARP-1 in muscarinic receptor-mediated sAPPα release.;아밀로이드 전구단백질 (amyloid precursor protein: APP)은 내재성 막 당 단백질 (integral membrane glycoprotein)으로서, 대사과정 중 아밀로이드 펩티드 (amyloid-β peptide: Aβ)를 생성한다. 아밀로이드 펩티드는 기억력 저하, 인지능력 저하, 주의력 저하, 사고력 저하와 판단력 저하 등의 임상적 증상과, 대뇌피질과 해마 또는 편도핵에서 neurofibrillary tangle과 senile plaque이 병리학적 증상을 나타내는 신경퇴행성 질환의 일종인 Alzheimer disease (AD)에 있어서, 학습과 기억 능력에 손상을 주는 요인으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 이에 반해, 정상적인 세포에서 APP의 대사 과정 중에 생성되는 용해성 아밀로이드 전구단백질 (soluble amyloid precursor protein: sAPPα)는 세포 밖으로 분비되어 세포의 생존, 증식과 부착을 조절하며 신경돌기의 발아 후 생육을 유도한다. APP의 분해과정에 대한 많은 연구가 행해져 왔고, 그 과정에 무스카린성 수용체가 관계한다는 사실이 보고되었으나, 무스카린성 수용체에 의한 sAPPα의 정확한 유리기전에 대해서는 아직 자세히 밝혀져 있지 않다. 이전의 연구에서 무스카린성 수용체 subtype중 M3가 다량 발현된 신경세포인 SH-SY5Y cells neuroblastoma cells을 이용하며 세포 배양액으로부터 유리된 sAPPα를 측정하였다. sAPPα는 정상적인 세포의 대사과정 중 세포배양액으로 유리되고, 무스카린성 효능제인 oxoM에 의해서 그 유리가 증가한다. 무스카린성 효능제에 의한 sAPPα의 증가과정은 세포 밖에서 세포 안으로 유입되는 Ca^(2+)에 의해 조절되었다. 이 때, 무스카린성 효능제에 의한 sAPPα의 유리증가는 capacitative calcium entry (CCE)를 통해 이루어지는 것으로 관찰되었다. 최근 우리 연구에서 NF-κB 가 무스카린 수용체의 활성화에 의한 CCE 형성과 sAPPα 분비과정에서 중요한 작용을 하는 것으로 관찰되었다. G protein-coupled receptors (GPCRs)가 phosphatidyl inositol (PI) 3-kinase/Akt pathway를 활성화 시킬 수 있고 이것이 NF-κB 의 활성화를 유도할 수 있다는 사실이 알려져 있다. 본 연구에서는 PI3-kinase/Akt pathway가 무스카린성 수용체 활성화에 의한 sAPPα 분비와 CCE 형성에서 어떤 역할을 하는지 연구하였다. 우리는 PI3-kinase 의 억제제인 wortmannin 또는 LY294002를 처리했을 때 무스카린성 수용체 활성화에 의해 유도되는 Ca^(2+) influx와 sAPPα의 유리가 크게 감소된 것을 관찰하였다. 이러한 결과는 PI3-kinase의 p85 regulatory subunit을 transfection하였을 때 sAPPα의 유리가 감소하는 것을 관찰함으로써 PI3-kinase의 역할을 뒷받침했다. 본 연구에서는 PI3-kinase의 중요한 downstream molecule이자 세포생존에 관여하는 것으로 알려져 있는 Akt가 무스카린성 수용체 활성화에 의한 sAPPα유리와 CCE 형성에 미치는 영향을 알아보았다. 우리는 SH-SY5Y cells 에서 무스카린성 수용체의 활성화가 Akt phosphorylation을 저하시키는 작용을 하는 것을 관찰하였다. Akt 억제제인 Akt inhibitor Ⅷ 과 SH-6를 처리하여 SH-SY5Y cells에서 Akt 억제제의 작용을 확인하고, 무스카린성 수용체 활성화에 의한 sAPPα분비와 Ca^(2+) influx에서 Akt의 역할을 알아보았다. 그 결과 Akt inhibitor Ⅷ은 Akt phosphorylation을 억제하고, 무스카린성 수용체 활성화에 의한 CCE 형성과 sAPPα 분비를 농도의존적으로 억제하는 것으로 나타났다. 반면, SH-6는 Akt phosphorylation을 억제하는 작용을 확실하게 나타내지 않았고, Ca^(2+) influx와 sAPPα에 대해서도 분명한 변화를 일으키지 않았다. 무스카린성 수용체 활성화에 의한 sAPPα분비와 CCE형성에 있어서 Akt가 미치는 영향을 더욱 확인하기 위해, wild type Akt (wtAkt)와 dominant negative Akt인 Akt K179M 및 PI3-kinase와 interaction 하지 않는 mutant인 Akt R25C construct를 SH-SY5Y cells에 transfection하였다. 그 결과, wtAkt 및 Akt K179M construct가 transfection된 세포에서는 phospho-Akt 와 total-Akt의 ratio에 분명한 변화를 일으키지 않은 반면, Akt R25C는 ration를 감소시켰고, Akt activity가 감소된 것을 알 수 있었다. 우리는 wtAkt 및 Akt K179M이 transfection된 SH-SY5Y cells에서 무스카린성 수용체의 활성화에 의한 Ca^(2+) response와 sAPPα 분비에서 변화를 볼 수 없었다. 그러나 Akt phosphorylation을 억제하는 것으로 나타난 Akt R25C가 transfection된 세포에서 sAPPα가 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 우리의 결과는 Akt가 PI3-kinase 작용의 생성물인 PIP3과 상호작용을 하는 pleckstrin homology (PH) domain이 Akt가 무스카린성 수용체 활성화에 의한 sAPPα분비에 관여하는데 중요한 역할을 할 수 있음을 제시해준다. 이러한 결과는 Akt가 무스카린성 수용체 활성화에 의한 CCE형성과 sAPPα 분비에 관여할 가능성을 보여주지만, Akt을 역할을 정의하기 위해서는 추가적인 실험이 필요하다. 이 연구의 또 다른 목적은 poly (ADP-ribose)polymerase-1 (PARP-1)이 무스카린성 수용체 활성에 의한 sAPPα 분비에서 어떤 역할을 하는지 알아보는 것이다. PARP-1은 진핵세포에서 널리 발현되는 nuclear enzyme으로 DNA 손상에 의해 활성화 되고 DNA-binding protein을 poly ADP-ribosylation 시켜 DNA의 전사를 조절하는 것으로 알려져 있다. 최근에 membrane depolarization과 inositol 1, 4, 5 trisphosphate (IP3)에 의한 Ca^(2+) 분비에 의해 PARP-1이 활성화 될 수 있다고 알려지면서, signaling transduction의 새로운 nuclear target으로 알려지고 있다. PARP-1 억제제인 3-aminobenzamide, PJ-34 그리고 nicotinamide는 모두 농도 의존적으로 무스카린성 수용체 활성화에 의한 sAPPα의 분비를 억제하였다. 그러나 무스카린성 수용체 활성화에 의한 Ca^(2+) influx는 PARP-1 억제제인 PJ34에 의해 변화를 나타나지 않았다. 이러한 결과는 PARP-1의 활성화가 무스카린성 수용체의 활성화에 의한 sAPPα 분비에 관여할 수 있다는 가능성을 보여준다. 이러한 무스카린성 수용체의 활성화에 의한 sAPPα의 유리의 조절 과정에 관한 일련의 실험결과들이, AD의 병리 기전을 좀더 명확히 이해하는 데 기여하고 AD의 치료제 개발에 있어서 새로운 지표를 제시할 수 있을 것이다.