Pharmacokinetics and Cytotoxicity of Micellar Paclitaxel Formulation

Abstract

Poor water solubility of drugs is a major obstacle in developing formulations and in administering them by intravenous injection. Paclitaxel, one of the best natural anticancer drugs for the past decades, has been limited in clinical use due to its poor aqueous solubility. In current clinical formulation of paclitaxel, a vehicle containing Cremophor EL and alcohol is needed to dissolve the drug. However, Cremophor EL has significant side effects such as hypersensitivity reaction, nephrotoxicity, and neurotoxicity. Therefore we prepared paclitaxel formulations without Cremophor EL in the present study: the micellar paclitaxel formulations with ESD-601-T13 and ESD-602-T15 and a paclitaxel conjugate with ESD-602-T14. The objectives of this investigation were to determine in vitro cycotoxicity of the micellar paclitaxel formulations and a paclitaxel conjugate and to study pharmacokinetics of the micellar paclitaxel formulation with ESD-601-T13, which has similar cytotoxicity to paclitaxel (Taxol??) in various cancer cells, in rats. The micellar paclitaxel formulations were prepared by micellar encapsulation of paclitaxel using amphiphilic phosphazene polymers, ESD-601-T13 and ESD-602-T15. A paclitaxel conjugate was prepared by conjugation of paclitaxel to an amphiphilic phosphazene polymer, ESD-602-T14. The in vitro cytotoxicity of the micellar paclitaxel formulations and a paclitaxel conjugate was evaluated using sulforhodamine B (SRB) staining assay in various cancer cell lines (MCF-7, MDA-MB-231, A-431, and SK-OV3). For the determination of paclitaxel in rat plasma, a HPLC method was developed and validated. Paclitaxel and n-hexyl p-hydroxybenzoic acid (I.S.) were extracted from plasma by one-step extraction with tert-butyl methyl ether. The samples were then injected onto a Capcell-pak C18 column with a mobile phase of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid (51:49, v/v) and detected at 227 nm. The pharmacokinetics of the micellar paclitaxel formulation was examined after an intravenous infusion at 5 mg/kg to rats. The micellar paclitaxel formulations with ESD-601-T13 and ESD-602-T15, showed significant cytotoxicity comparable to paclitaxel against four cancer cells studied. However, the paclitaxel conjugate with ESD-602-T14 was much less cytotoxic than paclitaxel with increased IC50 values compared with paclitaxel. Based on these results, the micellar paclitaxel formulation with ESD-601-T13 was finally chosen as a candidate for further in vivo pharmacokineitic study. The HPLC method for the analysis was successfully validated in terms of specificity, precision and accuracy. Paclitaxel and I.S. were eluted at 8.90 min and 16.7 min in rat plasma, respectively. The standard curve was linear over the concentration range from 0.01 to 50 g/mL. The pharmacokinetic parameters of Taxol and micellar paclitaxel formulation were estimated using a WinNonlin program with non-compartmental methods. The elimination half-life was increased in the micellar paclitaxel formulation compared with commercial IV formulation, Taxol (6.29 ± 2.51 hr vs. 3.54 ± 2.46 hr) while the mean AUC and Clt of micellar paclitaxel formulation were similar to those of Taxol. In conclusion, our study demonstrates that the micellar paclitaxel formulation has a potential to be a useful alternative to Taxol. Another edge over Taxol is that the micellar paclitaxel formulation is free from Cremophor EL that produces severe toxicities including hypersensitivity and peripheral neuropathy.;파클리탁셀은 지난 수십 년간 개발된 항암제 가운데 폐암, 유방암 및 난소암에 유효한 매우 우수한 천연 항암제이나 수용성이 매우 낮아 임상적 사용이 제한적인 단점을 가지고 있다. 현재 파클리탁셀은 약물의 용해성을 높이기 위해 Cremophor EL과 알코올을 용제로 사용한 탁솔(Taxol??) 주사제형이 임상적으로 사용되고 있다. 그러나 용제로 사용되는Cremophor EL 은 과민반응, 신장독성, 신경독성 등의 심각한 부작용을 일으키기 때문에 본 연구에서는 Cremophor EL 을 함유하지 않은 세가지 종류의 수용성 파클리탁셀 prodrug들(ESD-601-T13과 ESD-602-T15를 이용하여 만든 미셀형 파클리탁셀 포퓰레이션과 ESD-602-T14를 이용한 파클리탁셀 컨쥬게이트) 을 가지고 연구를 수행하였다. 본 연구의 목적은 수용성 파클리탁셀 prodrug 들의 in vitro 세포독성을 측정하고, 여러 암세포에서 파클리탁셀과 유사한 세포독성을 보였던 ESD-601-T13을 이용하여 제조된 미셀형 파클리탁셀 포뮬레이션의 쥐에서의 체내 동태를 연구하는 것이었다. 미셀형 파클리탁셀 포뮬레이션은 양친매성 포스파젠 고분자인 ESD-601-T13 과 ESD-602-T15 를 이용하여 파클리탁셀을 미셀 안에 봉입시킨 것이며, 파클리탁셀 컨쥬게이트는 파클리탁셀을 양친매성 포스파젠 고분자인 ESD-602-T14에 컨쥬게이트시킨 것이다. 수용성 파클리탁셀 prodrug들의In vitro 세포독성은 sulforhodamine B (SRB) 염색법을 이용하여 다양한 암세포 (MCF-7, MDA-MB-231, A-431, SK-OV3) 에서 평가되었다. 또한, 생체 시료 중 파클리탁셀의 HPLC 분석법을 개발하고 검증하여 쥐 혈장에서의 파클리탁셀을 검출하였다. 파클리탁셀과 n-hexyl p-hydroxybenzoic acid (내부표준물질) 을 tert-butyl methyl ether 를 이용하여 혈장으로부터 추출하고, 추출된 시료를 증발 건조하여 남은 잔사를 60% 아세토니트릴에 녹여 Capcell-pak C18 컬럼에 주입하였다. 아세토니트릴과 0.1% 인산 혼합액(51:49, v/v)으로 구성된 이동상을 1.3 mL/min의 속도로 움직이며 자외선 파장 227 nm에서 파클리탁셀을 검출하였다. 또한, 미셀형 파클리탁셀 포뮬레이션을 쥐들에게 5 mg/kg 으로 정맥주사하여 체내 동태를 연구하였다. ESD-601-T13과 ESD-602-T15를 이용하여 제조한 미셀형 파클리탁셀 포뮬레이션들은 네 종류의 암세포에서 파클리탁셀과 유사한 세포독성을 나타내었다. 그러나 ESD-602-T14를 이용하여 제조한 파클리탁셀 콘쥬게이트는 대조군인 파클리탁셀과 비교하였을 때 세포에 대한 독성을 감소시켰다. 이 결과들을 바탕으로 ESD-601-T13을 이용하여 제조한 미셀형 파클리탁셀 포뮬레이션을 쥐에서의 체내 동태를 연구하기 위한 후보물질로 선정하였다. HPLC 분석법은 충분한 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 가지고 검증되었다. 파클리탁셀과 내부표준물질은 쥐의 혈장에서 각각 8.90 분과 16.9 분에 검출되었고 검량선은 0.01 – 50 g/mL 의 농도범위에서 양호한 직선성을 보였다. 탁솔과 미셀형 파클리탁셀 포뮬레이션의 약물동태학적 파라미터들은 non-compartmental 방법으로 WinNonLin 프로그램 (Ver. 4.0) 을 사용하여 도출하였다. 미셀형 파클리탁셀 포뮬레이션의 반감기는 탁솔에 비해 상당히 증가한 반면 (6.29 ± 2.51 hr vs. 3.54 ± 2.46 hr), 평균 약물농도-시간곡선 하 면적 (AUC) 및 클리어런스는 탁솔과 유사하였다. 결론적으로 미셀형 파클리탁셀 포뮬레이션은 네 종류의 암세포에서 대조군인 파클리탁셀과 동등한 정도의 세포독성을 나타내었고 쥐에서 유사한 체내 동태 양상을 보였다. 또한, 과민반응이나 말초 신경독성 등의 심각한 부작용을 일으키는 Cremophor EL없이 제조되어 상용화되고 있는 탁솔에 비해 독성을 낮추었으므로 탁솔과 동일한 적응증을 가진 보다 우수한 항암제로 개발될 가능성이 크다고 사료된다.