인체 혈청 중 미조리빈의 HPLC 정량법 개발 및 체내 약물동태 연구

Abstract

인체 혈청 중 미조리빈의 정량을 위하여 자외부 검출기 (275 nm)를 이용한 간단하고 특이적이며 재현성이 있는 high performance liquid chromatography (HPLC) 분석법을 개발, 검증하였고, 이 방법을 이용하여 미조리빈의 체내 약물동태 연구를 수행하였다. 인체 혈청에 내부표준물질인 3-메틸잔틴과 70 % 과염소산을 가하고 진탕한 후 원심분리하였다. 깨끗한 상층액을 Luna C18 컬럼에 주입하여 분석하였고, 이동상으로는 20 mM 인산일수소나트륨액(pH 3, 인산으로 조정) ∙ 메탄올 혼합액 (97.5 : 2.5, v/v)에 0.04 (w/v)% 옥탄설폰산을 넣어 만든 액을 사용하였다. 검출파장은 275 nm, 유속은 1.2 mL/min이었다. 식품의약품안전청의 생체시료분석법 validation 가이드라인에 따라 분석법을 검증한 후, 8 명의 건강한 한국인 피험자를 대상으로 미조리빈 100 mg을 1회 경구 투여하고 약물동태학적 파라미터를 산출하였다. 미조리빈과 내부표준물질의 피크는 혈청 성분 등 내인성 물질의 간섭없이 양호하게 분리되었고, 유지시간도 미조리빈은 약 3.3 분, 내부표준물질은 약 10.1 분으로 적절하였다. 미조리빈의 검량선은 0.1-4 μg/mL 농도 범위에서 직선성을 나타내었고, 최저정량한계는 0.1 μg/mL이었다. 검증을 통해 분석법이 특이성, 정확성, 정밀성이 있는 것을 확인할 수 있었고, 따라서 이 분석법을 건강한 한국인 피험자를 대상으로 한 생체이용률시험에 적용할 수 있었다. 경구 투여한 결과 Tmax는 2.06±0.32 시간, Cmax는 1.92±0.42 μg /mL였고, 평균 AUCt는 11.3±2.00 μg ∙ hr/mL, 그리고 t1/2는 2.89±0.50 시간이었다. 결론적으로, 본 연구를 통하여 간단하고 특이적이며 정확성 및 재현성이 있는 인체 혈청 중 미조리빈의 HPLC 정량법을 개발, 검증할 수 있었다. 또한 이러한 분석법을 인체 혈청시료의 분석에 적용함으로써 건강한 한국인 피험자에서의 미조리빈의 약물동태학적 파라미터들을 구할 수 있는 토대를 마련하였다.;A simple high performance liquid chromatographic (HPLC) methodology was developed and validated for the quantification of mizoribine in the human serum. 3-methylxanthine (50 μL/mL, Internal Standard) and 70 % perchloric acid were first added into the human serum. The mixture was thoroughly mixed and centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes. The supernatant was injected onto the Luna C18 analytical column. The mobile phase used in this study consisted of methanol and 20 mM sodium phosphate dibasic buffer at pH 3 (2.5:97.5, v/v) containing 0.04 % octanesulfonic acid. Its flow rate was kept at 1.2 mL/min, and the eluent was detected at 275 nm. After the validation of the method according to the bioanalytical validation guide of Korea Food and Drug Administration, the pharmacokinetic parameters of mizoribine in eight subjects were determined following an oral administration of 100 mg mizoribine. The peaks of mizoribine and I.S. were well separated with the desirable retention times (mizoribine: 3.33 min, I.S.: 10.1 min) from endogenous substances in human serum. The calibration curve was linear over the mizoribine concentration range of 0.1-4 μg/mL and the lower limit of quantitation (LLOQ) was 0.1 μg/mL. The method was found to have excellent specificity, accuracy and precision. This method was successfully applied to pharmacokinetic study of mizoribine in Korean healthy subjects. The maximum serum concentration (Cmax) of 1.92 ± 0.42 μg/mL reached 2.06 ± 0.32 hr after an oral administration. The mean AUCt and the elimination half-life were 11.3 ± 2.00 μgㆍhr/mL and 2.89 ± 0.50 hr, respectively. In conclusion, the simple, specific, accurate and reproducible HPLC methodology was developed and validated for the determination of mizoribine in the human serum. In addition, this HPLC method allowed us to determine the human pharmacokinetic parameters of mizoribine in healthy Korean subjects for the first time.