Schizandrin 의 사람 유방암 세포에 대한 성장 저해 활성 연구와 Adenosine 유도체의 사람 폐암 세포에 대한 성장 저해 및 사멸 작용기전에 관한 연구

Abstract

Schizandrin (2', 3', 4', 1", 2", 3"-hexamethoxy-6,7-dimethyl-1,2,3,4-dibenzo-1,3-cyclooctadien-6-ol) isolated from Schizandra chinensis Bill (Schizandraceae) has not much elucidated for the anticancer activity yet. In this study, we examined the effects of schizandrin on cell proliferation in cultured T47D human breast cancer cells. Schizandrin exhibited the growth inhibition of breast cancer cells with the IC_(50) value of approximately 20 μM. To further investigate the mechanism of action on regulating cell proliferation, cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry. As a result, schizandrin-treated cells exhibited G_(0)/G_(1) and G_(2)/M phase accumulation. The cell cycle arrest was well related with the expression of regulating proteins, cyclin D1, CDK 4, cyclin E, cyclin A, CDK 2, cyclin B1 and its partner CDK 1. The modulation of expressions of pRb, p53, p21, p27, p-Akt, c-myc and PCNA gave us evidence that the growth inhibitory activity of schizandrin against breast cancer cells might be related with the cell cycle arrest at G_(0)/G_(1) and G_(2)/M phase. Schizandrin also affected the expression of Wnt signal-related proteins, p-GSK3a/b and β-catenin. Taken together, schizandrin-induced cell cycle arrest at G_(0)/G_(1)and G_(2)/M phase might be involved in the regulation of Wnt signaling pathway. Human A₃ adenosine receptor (A₃AR) agonists have been shown to play important roles in several physiological and pathological processes including growth inhibition of human cancer cells. On this line, we recently found that a novel adenosine analog, 2-chloro-N^6-(3-iodobenzyl)-4＇-thioadenosine-5＇-N-methyluronamide (thio-Cl-IB-MECA) is a potent human A₃AR agonist, and is superior to known agonists IB-MECA and Cl-IB-MECA. A novel A₃AR agonist, thio-Cl-IB-MECA, inhibited the growth of A549 human lung cancer cells by arresting cell cycle and induction of apoptosis. Thio-Cl-IB-MECA suppressed cell proliferation with the accumulation of cells in G_(0)/G_(1) phase arrest at lower concentrations, and induced apoptotic cell death at higher concentrations over 40 μM. At lower concentrations, thio-Cl-IB-MECA regulated the expression of proteins known to be related with G_(0)/G_(1) phase arrest and Wnt signaling pathway. The apoptosis caused by thio-Cl-IB-MECA was concomitant with the activation of caspases (3, 9) and decreased expression of Bcl-2, but it was independent with the expression of Bax and p53. In addition, thio-Cl-IB-MECA-treated cells exhibited the cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase. These data indicated that the inhibitory activity of cancer cell growth mediated by thio-Cl-IB-MECA might be associated with the cell cycle arrest via Wnt signaling pathway and the induction of apoptosis. These findings suggest that schizandrin isolated from Schizandra chinensis and a novel A₃AR agonist, thio-Cl-IB-MECA might be lead candidates for further development for or anticancer agents.;우리 나라의 질병으로 인한 사망원인 1위를 차지하고 있고, 그 이환율 및 사망률이 매년 증가 추세에 있는 암은 현대인들의 생명을 위협하는 가장 심각한 질환이다. 발생 장기에 따라 암의 종류는 매우 다양한데, 위암, 간암, 자궁암 등 조기진단을 통한 관리가 비교적 용이한 암은 지난 10년 간 사망률이 감소한 반면, 폐암, 대장암, 췌장암, 여성유방암, 전립선암 등은 오히려 사망률이 증가하였을 뿐 아니라 흡연인구의 증가, 고지방식이 섭취 증가, 환경 오염물질의 증가, 음주 섭취량의 증가 등으로 가까운 미래에도 꾸준히 증가할 것으로 예측하고 있다. 여러 종류의 암 중에서도 현재 우리 나라 여성의 악성 종양 중 1위를 차지하고 있는 유방암과 암으로 인한 사망률 1위를 차지하고 있는 폐암을 치료하기 위한 연구와 새로운 치료제를 개발하기 위한 연구가 절실히 필요한 실정이다. 오미자로부터 추출한 가장 대표적인 lignan 인 schizandrin 을 사람 유방암 세포인 T47D 세포에 농도 별로 처리한 결과 72시간에서 19.8 μM 의 IC_(50)값으로 세포 성장을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다. 암세포 성장 저해 작용기전을 알아보기 위해 fluorescent activated cell sorter(FACS) 를 수행한 결과, schizandrin 에 의해 유방암 세포의 G_(1) phase 와 G_(2)/M phase cell cycle arrest 가 유발된다는 사실을 알 수 있었다. 이를 확인하기 위해 western blot 을 수행하여 cell cycle 관련 marker 들의 발현 변화를 알아 본 결과, schizandrin 이 세포 주기 단계 중 G_(0)/G_(1) 과 G_(2)/M phase arrest 와 관련된 다양한 단백질 발현에 변화를 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었고, 세포 증식과 관련된 Wnt 신호전달 관련 단백질의 발현 변화를 일으킴으로써 결국에는 세포증식이 억제된다고 판단할 수 있었다. 결과적으로, 이 물질은 암세포를 사멸시키는 암 치료제는 아니지만 암의 증식을 지연시키는 효능이 있는 것으로 여겨진다. 선택적인 A3 수용체 효능제로 최근 개발된 아데노신 유도체인 2-chloro-N^6-(3-iodobenzyl)-4＇-thioadenosine-5＇-N-methyluronamide (thio-Cl-IB-MECA) 는 암 세포 증식 억제와 세포사멸 효과는 알려져 있으나, 아직 폐암과 관련하여서는 연구된 바가 없는 물질이다. Thio-Cl-IB-MECA 가 A549 사람 폐암 세포에 직접 작용하는 효과와 그 작용기전을 알아보고자 IB-MECA 와 비교하여 실험을 수행하였다. Sulforhodamine B (SRB) assay 를 통해 세포 독성 실험을 시행한 결과, 농도 의존적으로 세포 성장을 저해하여 72시간에서 IB-MECA 의 IC_(50)값은 42.18 μM, thio-Cl-IB-MECA 의 IC_(50)값은 15.69 μM 을 나타내었다. 이에 암세포 저해활성의 작용기전을 알아보고자 FACS 를 이용하여 세포주기를 분석해 보았는데, IB-MECA 를 처리하였을 때는 전체적으로 G_(1) phase 증가가 나타났고, thio-Cl-IB-MECA 를 처리한 군은 저농도에서 G_(1) phase arrest, 고농도에서 세포사멸이 나타났다. 또한 세포의 형태변화 관찰을 통해, 두 물질 모두 농도 의존적으로 세포 성장을 억제시킨다는 사실을 확인할 수 있었다. Western blot 실험을 통해 사람 폐암 세포 A549 cells 에서 thio-Cl-IB-MECA 가 저농도에서는 세포주기 단백질을 억제함으로써 세포 주기를 억제하는 역할과 Wnt 신호전달을 통해 세포 증식을 억제하는 역할을 하고, 고농도에서는 미토콘드리아를 통하는 apoptosis 경로를 통해 세포사멸을 일으킨다는 사실을 알 수 있었다.