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Transformation을 이용한 Streptomyces cattleya의 Carbapenem계 항생제 생산성의 향상

Title
Transformation을 이용한 Streptomyces cattleya의 Carbapenem계 항생제 생산성의 향상
Other Titles
Strain improvement for carbapenem productivity of S. cattleya by transformation
Authors
朴志宣
Issue Date
1994
Department/Major
대학원 약학과
Keywords
TransformationStreptomyces CattleyaCarbapenem계항생제
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Abstract
Streptomyces cattleya is a producer of carbapenem antibiotics, thienamycin and N-acetylthienamycin, which have potent and broad-spectrum antibacterial activities. We studied on strain improvement for carbapenem productivity of S. cattleya by transformation technique which employed S. cattleya protoplast and chromosomal DNAs of glutamic acid producers: Corynebacterium glutamocum and Arthrobacter simplex. Protoplasts of A-32, an arginine auxotroph of S. cattleya produced by UV irradiation, were transformed and its regeneration efficiencies on MRM with various compositions were investigated. On modified MRM shich contained 0.4M sucrose, 20mM CaCl_(2) and glutamic acid, regeneration efficiency of A-32 protoplasts was enhanced by 3.4-fold than MRM. Transformation efficiencies were 3.88 × 10^(-5)/cell when 5㎍ chromosomal DNA of C, glutamicum was added to 4 × 10^(6) S. cattleya protoplasts and 3.70 × 10^(-5)/cell when 2.5㎍ chromosomal DNA of A. simplex was added to 4 × 10^(6) S. cattleya protoplasts. 150 Transformant strains were cultured and bioassayed using Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus as test organisms. 8.7% Of transformants tested showed 1.4-2.6 fold higher productivities than wild type which produces 1.61 ± 0.67㎍/ml. The best strain produced 8.36 ± 2.84㎍/ml carbapenems.;Streptomyces cattleya는 carbapenem계 항생제인 N-acetylthienamycin, thienamycin 등을 생산하는 균주이다. Carbapenem계 항생제는 강력하고 광범위한 항생효과를 가지며 β-lactamase에 의한 가수분해에 저항성이 높아 β-lactam계 항생제에 내성을 획득한 많은 균의 감염증에 사용되어 뇌수막염, Legionella증, acute systemic infection, multiple organism infection등 각종 세균의 감염증에 쓰이고 있다. S. cattleya에서 carbapenem계 항생물질의 생합성은 g1utamic acid로부터 시작된다고 알려져 있다. (Fig.1. ) 본 연구에서는 이 균주에서 carbapenem계 항생물질의 전구물질인 glutamic acid의 생합성이 증가할 때 carbapenem계 항생물질의 생산성이 향상될 것을 기대하여 glutamic acid를 생산하는 균주인 Corynebacterium glutamicum과 Arothrobacter Simplex의 chromosomal DNA를 S. cattleya에 transformation시키는 실험을 수행하였다. Transformation의 선별 표식으로 이용하기 위하여 S. cattleya의 포자를 자외선 조사하여 arginine 영양요구주 A-32를 얻었으며, 이를 원형질체로 만들어 transformation에 사용하였다. A-32 arginine 영양요구주의 원형질체 재생배지로는 Minimal medium에 Mgcl_(2), Cacl_(2)를 첨가한 배지가 유용함을 알아 이를 Minimal regeneration medium(MRM)이라 하였으며, 이 MRM의 성분을 변화시켜 원형질체 재생의 최적화를 검토하였다. 그 결과 sucrose를 0.4M 첨가하고 MRM의 성분인 Cacl_(2)를 25mM에서 20mM로, amino acid를 asparagine에서 glutamic acid로 변화시켰을 때 A-32 원형질체의 재생효율이 28.49 ± 0.83%로 기본 MRM 8.32 ± 0.88%에 비해 3.4배 증가함을 알 수 있었다. A-32 원형질체 4 X 10^(6)개에 PEG를 이용한 chromosomal transformation을 실시하였을 때 transformation 효율은 C. glutamicum의 chromosomal DNA의 경우 5㎍을 가했을 때 3.88 X 10^(-5)/cell이었고, A. simplex의 chromosomal DNA의 경우 2.5㎍을 가했을 때 3.70 X 10^(-5)/cell이었다. Transformation으로 생성된 colony중 150개를 액체배양하여 B. subtilis, S. aureus를 이용한 bioassay로 정량하여 carbapenem의 생성량을 thienamycin의 양으로 환산하였을 때 원 균주보다 생산성이 1.4 - 2.6배 증가된 균주들을 13개(8.7%) 얻을 수 있었으며 생산성이 4.1, 5.2배 향상된 균주도 얻을 수 있었다.
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일반대학원 > 생명·약학부 > Theses_Master
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