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Regulation of collapsin response mediator protein-2 cleavage in ischemia-induced PC12 cells

Title
Regulation of collapsin response mediator protein-2 cleavage in ischemia-induced PC12 cells
Authors
고문정
Issue Date
2005
Department/Major
대학원 약학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Abstract
Focal cerebral ischemia results in irreversible damages in infarcted area and the brain damage in ischemic stroke can be attributed to neuronal cell death resulting from an insufficient supply of glucose and oxygen to brain tissue. In previous study, we found that the expression of collapsin response mediator protein (CRMP)-2 was altered in focal ischemic rat brain tissues. CRMP-2 has been identified as an intracellular protein which is activated by a repulsive guidance molecule, Semaphorin 3A and plays an important role in axonal growth and guidance in the nervous system, but its role in ischemia has not been addressed. In the present study, we studied whether the CRMP-2 expression is also altered in vitro ischemia (oxygen-glucose deprived anoxic condition)-induced pheochromocytoma (PC12) cells, and its regulation were examined. Similar to the observation in ischemic rat brain, the expression level of the major 62 kDa CRMP-2 protein appeared at the highest level in normoxic condition was gradually diminished according to the ischemic duration, whereas the 58 kDa CRMP-2 protein assumed as a cleaved product was newly detected in ischemic condition. Cells treated with H₂O₂ at high concentration which induces poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage did not induce the 58 kDa CRMP-2 expression, indicating that the 58 kDa CRMP-2 expression is independent of caspase-3 activation. The formation of 58 kDa CRMP-2 in ischemic condition was inhibited by treating cells with extracellular Ca^(2+) chelator, EGTA, and non-selective voltage-gated Ca^(2+) channels (VGCCs) blocker, Cd^(2+), showing that extraceullar Ca2+ entrance through VGCCs is important in the 58 kDa CRMP-2 formation. To confirm the importance of extracellular Ca^(2+) entrance, we treated A23187, a calcium ionophore. A23187 treatment accelerated the change of CRMP-2 expression in ischemic condition and we observed that only A23187 treatment in normoxic condition without ischemic insults could induce the 58 kDa CRMP-2 indicating that Ca^(2+)-dependent pathways importantly regulate the 58 kDa CRMP-2 formation. We also observed that the CRMP-2 expression in ischemic condition was prevented by calpain inhibitor but not by caspase inhibitor confirming again that caspase activation is not a regulating factor in CRMP-2 cleavage and Ca2+ is a major contributor in CRMP-2 cleavage because calpain activity depends on intracellular Ca^(2+) concentration. Moreover, in vitro digestion of CRMP-2 in cell lysate with μ-calpain showed a cleavage form identical to that observed in ischemic cells and it was blocked by a calpain inhibitor, calpeptin. These results provide a potential evidence that calpain could directly cleave CRMP-2 in ischemic condition. We investigated the relationship of 58 kDa CRMP-2 with cell viability by MTT assay and flow cytometry. Cell viability was decreased by increasing ischemic duration, and the flow cytometry experiment using dyes detecting necrosis or apoptosis showed that most of ischemic cells appeared necrotic cell death. Although treatment of EGTA completely blocked CRMP-2 cleavage in ischemic condition, cell viability measured by MTT assay and flow cytometry analysis was not changed. In the present studies, we showed the importance of Ca^(2+) in regulating CRMP-2 cleavage, moreover, we demonstrated the first time that CRMP-2 could be a calpain substrate in ischemia. Although prevention of the CRMP-2 cleavage did not relieved ischemic cell death, it is possible that the 58 kDa cleaved form of CRMP-2 could play important roles in ischemic cell death cascade. The functional role of 58 kDa CRMP-2 remains to be determined that might provides new therapeutic strategies to ischemic stroke.;뇌졸중은 뇌로의 당과 산소등의 공급이 중단되어 나타나는 뇌허혈로 인해 뇌에 심각한 손상을 입히게 된다. 본 연구에서 우리는 뇌허혈 모델을 in vitro 상에서 유도하기 위해, PC12 세포를 당과 혈액이 없는 상태에서 무산소 배양하였다. 이처럼 허혈을 유발한 모델에서 collapsin response protein (CRMP)-2 라고 하는 단백질의 발현이 변하는 것을 확인하였는데 CRMP-2는 Semaphorin3A라고 하는 repulsive guidance molecule에 의해 활성화되며, 신경에서의 axonal growth와 guidance에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 단백질이다. 하지만 허혈모델에서 CRMP-2에 대한 변화 및 역할에 대한 연구는 거의 이루어진 바가 없다. 정상적인 조건에서 CRMP-2는 62 kDa의 단백을 나타내게 되는데, 허혈 유발시에는 58 kDa의 새로운 사이즈에서의 CRMP-2가 발견되며, 이는 잘려진 형태의 CRMP-2라고 여겨진다. 허혈 유발시, 이처럼 CRMP-2의 절단뿐만 아니라, PARP의 절단도 감지가 되었는데, 이는 우리 허혈 모델에서 caspase가 활성화됨을 말해주고 있다. Caspase활성과 58 kDa CRMP-2 생성의 관련성을 연구하기 위해, H₂O₂를 처리한 모델에서 caspase와 CRMP-2 발현을 관찰하였다. H₂O₂를 처리하였을 때, 고농도의 H₂O₂의 처리에 따라 PARP가 절단되는 것을 확인하였으나, 58 kDa의 CRMP-2는 관찰 되지 않았으며, 이는 caspase의 활성이 CRMP-2의 절단과는 긴밀한 연관성이 없음을 보여주고 있다. 허혈시 세포내 칼슘의 상당한 증가는 이미 잘 알려져 있으며, 이러한 칼슘증가가 허혈에 의한 신경손상에 중요한 중계자라는 것이 일반적으로 받아들여지고 있는 사실이다. 특히 세포외 칼슘의 세포내 유입과 세포내 저장고로부터의 칼슘 방출이 이러한 세포내 칼슘증가에 큰 역할을 하고 있다. 따라서, 세포내 칼슘의 증가와 CRMP-2 절단과의 상관성을 알아보기 위해 실험을 진행하였다. 세포외 칼슘을 완전히 제거하기 위해, EGTA를 처리하니 58 kDa의 CRMP-2의 생성의 거의 완전하게 소실되는 것을 확인하였고, 또한 Voltage-Gated Ca^(2+) Channels (VGCCs) 억제제인 Cd^(2+) 의 처리에 의해 CRMP-2의 절단이 억제되는 것을 확인함으로서, 세포외 칼슘의 VGCCs를 통한 세포내 진입이 58 kDa의 CRMP-2 생성에 있어 중요한 조절인자임을 알아냈다. 그리고 칼슘 ionophore인 A23187의 처리 실험에서, 허혈 상태에서 A23187을 처리시, 62 kDa 의 CRMP-2 소실과 58 kDa의 CRMP-2의 생성이 농도의존적으로 가속화되었다. 더욱이 허혈을 유발하지 않은 정상적인 조건에서 A23187의 처리만으로도 58 kDa CRMP-2가 생성되었는데 이는 칼슘이 CRMP-2 절단에 매우 긴밀하게 연관되어 있음을 다시금 시사해주고 있다. 허혈시 활성화 되는 대표적 효소로 대두되고 있는 것이 calpain과 caspase 이다. Caspase는 apoptosis와 긴밀하게 연관되어 있으며, calpain은 주로 necrosis와 연관되어 있다고 알려져있으나, apoptosis에도 관련을 하고 있다는 보고가 알려지고 있다. Calpain은 칼슘의존적인 cysteine protease로서 활성화를 위해 세포내 칼슘의 증가를 필요로한다. 허혈시 calpain과 caspase가 활성화 된다는 연구가 알려져 있으며, 그리하여 CRMP-2의 절단이 이 두 효소와 관련성이 있는지 확인하기 위해 각각의 저해제를 처리하여 58 kDa의 생성 변화를 관찰하였다. Caspase 저해제인 Z-VAD-FMK를 처리하였을 때, 58 kDa의 생성은 억제되지 않았으며, 이는 앞서 H₂O₂의 실험에서 caspase의 활성과 58 kDa의 생성이 무관하다는 결과와 일치한다. Calpain 저해제인 calpeptin을 처리하였을 때, CRMP-2의 절단이 농도의존적으로 억제됨을 확인하므로써 CRMP-2의 절단에 calpain을 중요한 효소로 여기게 되었다. 또한, 세포 lyate에 직접 calpain을 처리하였더니, 허혈시 생성된 58 kDa의 band와 동일한 band를 확인할 수 있었는데, 이는 calpain이 직접적으로 CRMP-2를 절단을 매개하고 있음을 알려주고 있다. 이 결과를 보다 더 확실히 하기 위해서는 CRMP-2만을 순수 정제한 후, calpain 을 처리해보는 좀 더 직접적인 실험을 필요로 할 것이다. 허혈에서의 세포 사멸을 알아보기 위해 MTT assay와 flow cytometry를 시행 하였다. 허혈 시간이 길어짐에 따라 세포의 생존률이 현저하게 감소하는 것을 확인하였으며, apoptosis와 necrosis를 구별할 수 있는 YO-PRO-1과 Propidium Iodide (PI)라는 두 dye를 통해 우리의 허혈 모델에서의 세포 사멸을 심도있게 관찰해 본 결과, 대부분의 세포들이 necrosis를 나타냄을 확인하였고, 허혈 초반 모델에서도 apoptosis를 거의 찾아볼 수 없었던 결과로 미루어 우리의 허혈모델이 necrosis와 긴밀하게 연관되어 있음을 시사한다고 할 수 있다. 58 kDa과 세포생존과의 연관성을 알아보기 위해 약물 처리 후 세포 생존률을 관찰한 결과 어떤 약물에서도 세포생존률이 증가되는 것을 확인할 수는 없었다. 더욱이, EGTA와 같이 58 kDa의 생성을 완전하게 막았던 약물군에서도, 세포 사멸을 억제하지는 못한다는 결과를 얻었다. 본 연구에서 우리는 허혈시 새로 발현되는 58 kDa CRMP-2의 조절과 그 기능에 대해 연구하고자 하였다. 58 kDa CRMP-2의 생성에는 VGCCs을 통한 세포외 칼슘의 세포내 유입이 매우 중요한 역할을 하며, 세포내 칼슘증가로 인한 calpain의 활성화가 CRMP-2의 절단에 매우 긴밀하게 연관되어 있음을 밝혀내었다. 이 연구는 CRMP-2와 calpain의 관련성을 알려주는 최초의 연구라는데 의의가 있으며, 비록 58 kDa CRMP-2 생성 억제가 세포 생존에 큰 영향을 주지는 못했지만, 허혈에 의해 유발되는 신경 손상에 있어 중요한 역할을 할 것이라 생각된다. 하지만 58 kDa CRMP-2의 역할에 관한 더 심도있는 실험이 요구되며, 이는 결국 뇌졸중과 같은 허혈에 의한 뇌손상의 병리 기전을 좀더 명확히 하여 새로운 치료제의 개발의 단서를 제공해 줄 것이라 기대된다.
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일반대학원 > 생명·약학부 > Theses_Master
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