Inhibitory Activity of P-glycoprotein by Phenolic Compounds of Plant Origin

Abstract

Multi-drug resistance (MDR) is a phenomenon that is often associated with reduced intracellular drug accumulation in tumor cells, resulting from enhanced drug efflux. It is widely known that P-glycoprotein (P-gp), encoded by human MDR1 gene, plays an important role in developing MDR in cancer cells. Many studies have shown that some natural compounds found in plants have not only anti-carcinogenic activities but may also modulate P-gp function. The purposes of this investigation were to examine the effects of naturally occurring compounds on P-gp activity in human breast cancer cell line, MCF-7/ADR, and to understand the mechanisms involved in P-gp inhibitory activity produced by naturally occurring compounds. Cytotoxicity was examined using sulforhodamine B (SRB) staining assay, and 2-hour accumulation of 0.05M [3H]-daunomycin (DNM), a P-gp substrate, was examined with and without the naturally occurring compounds. The effect of these compounds on DNM efflux was also determined. Verapamil, a well known P-gp inhibitor, was used as a positive control. As a result, four phenylbutenoid derivatives isolated from Zingiber cassumunar significantly increased DNM cytotoxicity. Especially, a phenylbutenoid dimmer, (±)-trans-3-(3,4-dimethoxyphenyl)-4-[(E)-3,4-dimethoxystyryl]cyclohex-1-ene, exhibited dramatic increase in [3H]-DNM accumulation and decrease in [3H]-DNM efflux, which were greater than those obtained with verapamil. In addition, (-)-syringaresinol and tricin isolated from Sasa borealis also showed effective inhibition on P-gp function, which reduced IC50 value of DNM effectively, and remarkably increased [3H]-DNM accumulation and significantly decreased [3H]-DNM efflux. All accordant effects of these compounds, such as increment in DNM cytotoxicity and [3H]-DNM accumulation, reduction in [3H]-DNM efflux, suggest that these compounds may have a potent P-gp inhibitory activity, indicating that it might be able to reverse MDR induced by anticancer drugs, and to use as a chemosensitizer in clinical chemotherapy. The mechanisms involved in the interaction with P-gp-mediated drug efflux were evaluated by determining effects of flvonoids and naturally occurring compounds on P-gp ATPase activity and cellular P-gp level. In the present study, none of flavonoids tested in this study showed significant changes in cellular P-gp level. Biochanin A, verapamil as well as (±)-trans-3-(3,4-dimethoxyphenyl)-4-[(E)-3,4-dimethoxystyryl]cyclohex-1-ene, and 4-(3,4-dimethoxyphenyl)but-1,3-diene isolated from Z. cassumuar markedly stimulated the P-gp ATPase activity whereas morin inhibited it. The stimulatory effects indicate that these compounds probably do not bind to the ATP-binding sites while morin may bind to the ATP-binding site and steroid-binging site of P-gp, and thus, prevent ATP hydrolysis. For better understanding of the mechanisms of naturally occurring compounds on the P-gp inhibitory activity, further [3H]-azidopine photoaffinity labeling study should be performed. Some of naturally occurring compounds found in plants exhibited potent P-gp inhibitory activity. These compounds may become promising candidates for chemosensitizer or MDR reversing agent with lower toxicity compared with first-generation of P-gp inhibitors to improve the efficacy of anticancer drugs when administration concomitantly.;약물의 다재내성(multidrug resistance, MDR)은 약물의 배출증가로 인한 세포 내 약물축적이 감소되는 현상과 관련되는데, MDR 1 유전자의 산물인 P-당단백질 (P-glycoprotein)이 다재내성 발현에 중요한 역할을 한다는 사실이 잘 알려져 있다. 식물에서 유래된 여러 성분들이 항암효과뿐 아니라 P-당단백질 활성을 조절한다는 사실이 여러 연구를 통해 보고되고 있다. 따라서 본 연구는 P-당단백질이 과다 발현된 인체 유방암 세포에서, 천연성분들이 P-당단백질 활성에 미치는 영향을 살펴보고, 이들 천연성분들에 의한 P-당단백질을 매개로 하는 약물 배출에 관련된 기전을 이해하는 것을 목적으로 한다. 천연성분들의 P-당단백질 저해 효과를 검토하기 위해서 sulforhodamine B (SRB) 염색법을 사용하여 세포독성 실험을 하였고, P-당단백질의 저해제인 베라파밀을 양성 대조군으로 사용하여 P-당단백질의 기질인 도노마이신 (DNM)의 세포 내 축적과 세포 밖으로의 배출 실험을 하였다. 그 결과, Zinger cassumunar로부터 분리된 단일 물질들 중 네 가지 phenylbutenoid 유도체들은 도노마이신의 세포독성을 유의성 있게 증가시켰다. 특히, (±)-trans-3-(3,4-dimethoxyphenyl)-4-[(E)-3,4-dimethoxystyryl] cyclohex-1-ene은 도노마이신의 세포 내 축적을 현저하게 증가시켰고, 세포 외로의 배출을 감소시켰다. 이는 대표적인 P-당단백질 저해제인 베라파밀보다 P-당단백질의 활성을 더욱 저해하는 것으로 나타났다. 또한 Sasa borealis로부터 분리한 (-)-syringaresinol과 tricin도 도노마이신의 IC50와 세포 외로의 배출을 효과적으로 감소시켰으며, 도노마이신의 세포 내 축적을 유의성 있게 증가시키는, 효과적인 P-당단백질 저해 효과를 보였다. 세포독성의 저하 및 도노마이신의 세포 내 축적의 증가 및 세포 외로의 배출의 감소라는 일관 된 결과들은 이 천연성분들이 유력한 P-당단백질 저해 효과를 가졌으며, 이들을 항암치료 시 항암증감제로 사용할 수 있음을 시사한다. P-당단백질 매개한 약물의 배출 기전을 알아보기 위해 P-당단백질 저해 활성을 가진 플라보노이드와 다른 천연성분들의 P-당단백질 ATPase 활성과 세포의 P-당단백질 발현에 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과, P-당단백질 저해 효과를 갖는 플라보노이드는 P-당단백질 발현에는 유의적인 변화를 보이지 않았으며, Zinger cassumunar로부터 분리된 4-(3,4-dimethoxyphenyl)but-1,3-diene와 (±)-trans-3-(3,4-dimethoxyphenyl)-4-[(E)-3,4-dimethoxystyryl]cyclohex-1-ene 뿐만 아니라, biochanin A, verapamil은 P-당단백질 ATPase의 활성을 현저히 증가시켰고 morin은 이를 감소시켰다. P-당단백질 ATPase 활성의 증가는 이 천연성분들이 ATP 결합부위와는 결합하지 않으며, 감소효과를 보이는 morin이 ATP-결합 부위나 스테로이드 결합 부위와 상호작용을 하여 ATP hydrosis을 방해한다는 것을 의미한다. 천연성분들의 P-당단배질 저해 기전의 좀더 잘 이해하기 위해서는 기질 결합부위와 직접적인 상호작용을 알 수 있는 [3H]-azidopine photoaffinity labeling 연구가 수행되어야 할 것이다. 본 연구를 통하여 강력한 P-당단백질의 억제 효과를 나타내는 일부 천연성분들을 확인할 수 있었다. 이들을 항암증감제로 개발하여 항암제와의 병용 투여로써 암 치료효과를 향상시킬 수 있으리라 기대된다.