Brazilin의 산화적 스트레스 조절을 통한 암예방 효능 연구

Abstract

암의 발생 요인은 아직 정확히 밝혀지지는 않았으나 H₂O₂, O₂^-., OH. 등의 활성 산소종이 DNA, 단백질, 세포막에 손상을 미쳐 세포의 비정상화를 초래하여 암화를 초래한다고 알려지고 있다. 따라서 체내 활성 산소종의 발생을 억제하는 방어기전에 해당하는 경로를 활성화 시킨다면 세포의 암화를 제어하는 한 방법일 수 있으며, 이러한 개념에서 활성 산소종의 생성을 억제함으로서 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는 항산화 및 glutathione S-transferase (GST), quinone reductase (QR) 과 같은 phaseⅡ 효소의 발현 증가를 통해서 정상세포의 암화를 예방할 수 있을 것으로 여겨진다. 본 연구에서는 소목 (Caesalpinia sappan L.) 에서 분리된 물질인 brazilin 을 대상으로 phase Ⅱ 효소의 발현 조절 및 항산화 활성을 평가하고, 그 작용기전을 연구함으로서 암 예방제로서의 가능성을 평가하여 보았다. Brazilin 은 mouse macrophage cell line 인 RAW 264.7 에서 lipopolysaccharide (LPS) 에 의해 유도 된 inducible nitric oxide (iNOS) 의 활성을 효과적으로 저해하였는데 이러한 brazilin 에 의한 nitric oxide (NO) 생성 저해 작용은 단백질 및 유전자 발현의 저해에 기인하는 것으로 확인되었다. 또한 brazilin 이 iNOS 의 transcription factor 로 알려진 NF- κB 와 AP-1 의 DNA binding activity 에 대한 저해활성을 보였으므로 brazilin 이 iNOS 의 발현을 전사단계에서부터 조절하는 것을 알 수 있었다. 다음으로 대표적 phase Ⅱ 효소로 알려진 QR 의 유도활성 시험을 시행한 결과 brazilin 에 의해 QR 의 활성이 농도 의존적으로 증가되는 것을 관찰 하였고, 이러한 작용도 마찬가지로 QR 단백질 및 mRNA 가 발현을 유도시키는 기전을 통하여 이루어졌다. 동시에 산화적 스트레스에 의한 세포 보호 작용을 하는 효소로 알려진 heme oxygenase-1 (HO-1) 의 단백질과 mRNA 도 brazilin 에 의해 유도가 증가 되는 것을 확인하였다. ARE 매개 유전자 발현과 quinone reductase (QR) 및 heme oxygenase-1 (HO-1) 유도활성 발현의 전사단계에는 Nuclear factor-E2-related factor 2 (Nrf2) 가 관여하는 것으로 알려져 있는데, 이와 관련하여 brazilin 처리 시간이 증가함에 따라 Nrf2 의 핵 내 이동 또한 증가하는 것으로 확인되었다. 또한 brazilin 처리에 의한 Nrf2 의 transcriptional activity 가 증가하는 것이 확인되었다. 이를 통하여 brazilin 에 의해 Nrf2 가 핵 내로 이동하게 되고, ARE/EpRE 의 Nrf2 binding site 에 결합하게 되어 phase Ⅱ 해독화 효소들과 항산화 효소들의 발현 유도가 일어난다는 것을 확인할 수 있었다. 즉 brazilin의 phase Ⅱ 해독화 효소들과 항산화 효소들의 유도활성에 관여하는 전사조절인자로 Nrf2 가 중요한 기능을 하는 것으로 생각된다. 한편, brazilin 이 항산화 효능을 평가해 본 결과 brazilin 은 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical 을 농도 의존적으로 소거하는 효능을 보였다. 또한 Hepa1c1c7 mouse hepatoma cell line 에서 H₂O₂ 와 hypoxanthine/xanthine oxide (HX/XO) 와 같은 산화적 스트레스를 유발했을 때, brazilin 이 이러한 산화적 스트레스로 인한 세포사멸을 억제하는 것을 통해 산화적 스트레스로부터 보호 효능을 가지는 것을 보았다. 결론적으로 brazilin 은 phase Ⅱ 해독화 효소 발현 증가와 동시에 항산화 효능을 가짐으로서 암의 개시단계를 예방할 수 있는 암 예방제로 적용될 수 있을 것으로 생각된다.;Free radical and other reactive oxygen species (ROS) appear to be broadly recognized as major contributors to cellular aging, degenerative diseases, and cancer. Especially, ROS has been known to affect at the initiation stage of carcinogenesis. Therefore, compounds which block the formation of free radicals or detoxify bioactive metabolites might be considered as cancer chemopreventive agents. On this line, in this study we evaluated the cancer chemopreventive effect of brazilin (7,11b-dihydrobenz[b]indeno[1,2-d]pyran-3,6a,9,10 (6 H)-tetrol), isolated from Caesalpinia sappan, on protective effect against cellular oxidative stress and regulation of phase Ⅱ detoxifying enzyme. First we evaluated the inhibitory effect of brazilin on nitric oxide (NO) production and investigated its mechanism of action. As a result, brazilin exhibited the inhibitory effect on lipopolysaccharide (LPS)-stimulated NO production in a dose-dependent manner (IC_50 = 24.3 μM). In addition, brazilin suppressed LPS-induced iNOS protein and mRNA expression in RAW 264.7 macrophage cells, indicating that the inhibitory activity of brazilin possibly involved in the regulation of iNOS expression. The DNA binding activity of NF-κB and AP-1 stimulated LPS was inhibited by treatment of brazilin in a dose-dependent manner, suggesting that brazilin-mediated inhibition of NO production might be associated with the regulation of transcription factors NF-κB and AP-1. NAD(P)H: quinone reductase (QR) plays an important role in cancer chemoprevention, presumably at the initiation stage of carcinogenesis. On this line, we evaluated the effect of brazilin on the regulation of phase Ⅱ enzyme expression in mouse hepatoma Hepa 1c1c7 cells. As a result, brazilin induced QR activity in a dose-dependant manner. To further elucidate the mechanism of induction of QR activity mediated by brazilin, the expression of QR gene as well as cellular defensive enzymes, heme oxygenase 1 (HO-1) was analyzed by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) techniques and examined protein level by western blotting. Brazilin induced QR and HO-1 gene expressions in a dose-dependent manner. To elucidate the mechanism of phase Ⅱ enzyme induction, we tested transcription factor with Nrf2, an important role on antioxidant response element (ARE), by western blot analysis and ARE-luciferase reporter gene assay. As a result, we found that brazilin has an activity on translocation of Nrf2 protein and increase of Nrf2 transcriptional activity. The DNA binding activity of ARE (contained Nrf2 binding site) by brazilin was shown in a dose-dependent manner. These results suggest that brazilin-mediated induction of phase Ⅱ enzyme might be associated with the regulation of transcription factor Nrf2. In addition, we investigated the protective effect of brazilin against the cellular oxidative stress. Brazilin exhibited free radical scavenging activity determined by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) in a dose-dependent manner. Oxidative stresses induced by exogeneous H₂O₂ or hypoxanthine/xanthine oxidase systems in Hepa 1c1c7 cells evoked the increase of cell death, and the cell viability was protected by the co-treatment of brazilin. These effects indicate that brazilin possesses the potential of antioxidant activity against cellular oxidative stress. In conclusion, these results suggest that brazilin might be valuable to protect against oxidative stress-induced degenerative diseases.