신합성 Quinone 유도체의 혈관이완 억제 및 흰쥐 뇌 Nitric oxide 억제 활성

Abstract

Nitric oxide (NO) is an effector molecule with multiple effects on various organ system. NO is produced in physiological and phathological conditions by three distint isoforms of NO synthase (NOS) : endothelial NOS (eNOS), neuronal NOS (nNOS), inducible NOS (iNOS). Although NO mediates several physiological functions, overproduction of NO by nNOS has been reported in a number of clinical disorders including acute (stroke) and chronic (shizophrenia, Alzheimer's, Parkinson's and AIDS dementia) neurodegenerative diseases, convulsion and pain; over production of NO by iNOS has been implicated in various phathological processes including septic shock, tissue damage following inflammation and rheumatoid arthritis. Although there may be pathologies associated with over-activity of eNOS, blood pressure homeostasis is critical and complex so that most investigators believe therapeutically useful NOS inhibitors must not inhibit eNOS. Therefore isoform selectivity will be required to achieve therapeutic efficacy with a reasonable safety margin, and iNOS and nNOS inhibitors have attractive therapeutic potential. Quinones represent an important class of naturally occuring compounds that are found in plants, fungi and bacteria, primarily as important components of the electron transport chains involved in cellular respiration and photosynthesis. Several quinoid compounds are reported for their inhibitory actions on NOS. In the present study, inhibitory action of variety of newly synthesized quinone compounds, 6-arylamino-5,8-quinolinediones (SAs) , 6-arylamino-5,8-quinazolinediones (SBs), 7-arylamino-5,8-isoquinoline diones (SCs), 7-arylamino-5,8-quinazolinediones (SDs), 6-arylamino-2-(2- pyridyl)-4,7-benzimidazolediones (SEs), 5-hydroxynaphthalene-1,4-diones (SFs), 6-arylamino-2,3-dimethylquinoxaline-5,8-diones (SGs) and 3-(hydroxy methyl)-1-methyl-5-(phenylamino)-1H-indole-4,7-diones (SHs) on vasorelaxation of rat aorta and synthesis of nitric oxide in rat brain homogenates were examined and proposed isoform-seletive inhibitors were screened. Several compounds showed remarkable inhibitory action on vasorelaxation of rat aorta and/or synthesis of nitric oxide in rat brain homogenate. This inhibitory effect of screened novel class of quinone compounds seems to be due to shunting the electron flow from the cofactor NADPH resulting in the inhibition of NO formation by its binding to NOS reductase domain. The compounds shown inhibitory effect on vasorelaxation with LPS-treated rat is proposed as iNOS inhibitors to be able to use for septic shock and immune diseases. Also, the compounds shown inhibitory effect on NO synthesis in rat brain homogenates imply therapeutic potential as nNOS inhibitors for neurodegenerative diseases.;Nitric oxide (NO)는 L-arginine으로부터 nitric oxide synthase(NOS)에 의해 합성되는 신호전달물질로서 독성 및 보호작용을 동시에 가져 여러 종류의 관절염, 동맥경화, 암, 당뇨병 및 기타 퇴행성 뇌질환, 뇌졸중, 심근경색 등의 병태생리학적 조건과 관련됨과 동시에 정상적인 체내 조절기능인자로서 작용하는 물질이다. NOS는 크게 3가지로 대별되는 neuronal (nNOS), endothelial(eNOS), inducible (iNOS) isoform들이 존재하고, 각기 다른 체내 분포를 가진 각 isoform으로부터 생성된 NO는 각각 다른 특징적인 기능을 가진다. iNOS 및 nNOS에 의한 NO의 과잉생산은 여러 질병상태와 관련되어 nNOS에 의한 NO 과잉생산은 급만성 퇴행성 신경질환 즉, 정신분열증, 알츠하이머병, 파킨슨씨병 등과 AIDS성 치매와 같은 신경면역질환과 동통, 편두통 및 간질과도 관련있음이 보고된 바 있으며.iNOS에 의한 NO 과잉생산은 패혈증, 발작 (stroke), 암, 염증반응에 따른 조직괴사, 류마티스성 관절염 및 골관절염 등을 포함하는 염증성 질환, 제1형 당뇨병 및 다발성 경화증과 관련됨이 보고된 바 있다. NO는 이러한 다양한 병리현상과 직접적으로 관련되기 때문에 NOS 저해제를 개발하여 NO의 생리기능을 연구하기 위한 생화학적 시험물질로 뿐만 아니라 치료약으로 사용하고자 하는 노력이 계속되어 왔다. 특히 eNOS는 병리와 연관이 있다는 보고도 있으나 정상 혈압유지라는 필수적인 생리기능을 담당하고 있기 때문에, 합당한 안전역을 확보하면서 치료효과를 얻기 위해 eNOS에는 가능한한 영향을 주지 않고, nNOS나 iNOS에만 작용하는 선택적 NOS 저해제의 개발에 역점을 두고 있다. Quinone 화합물은 식물, 진균 및 세균 등에서 발견되는 물질로 세포호흡과 관계된 전자수송체 (electron-transport chain) 및 광합성에 중요한 물질이다. NOS 단백질의 C-terminal 부분은 cofactor binding site들이 존재하는 부분으로 cytochrome p450 reductase와 유사하며 기본적으로 같은 기능을 수행하여 reductase domain으로 구분하는데, 이 domain의 NADPH로부터 cytochrome c, 2,6-dichlorophenol indophenol, methylene blue와 nitroblue tetrazolium과 같은 artificial acceptor로 전자가 이동될 수 있는 것이 보고되었고, 구조내에 quinone moiety를 가지고 있는 anthracycline, doxorubicin과 aclarubicin이 흰쥐 소뇌에서 NOS 활성을 억제했다는 보고를 종합해 볼 때 quinone 화합물은 NOS reductase domain과 반응하여 NADPH로부터 전자의 artificial acceptor로 작용하여 NO 합성을 저해할 것으로 여겨진다. 본 연구에서는 NO 저해효과가 알려진 기존 화합물인 6-anilino-5,8-quinolinedione을 선도물질로 하여 새롭게 합성된 quinone 화합물 들과 기존의 NO 활성에 대한 보고가 전무한 새로운 구조의 quinone 화합물들을 대상으로 시험을 수행하였다. 우선 신합성 quinone 화합물들을 가지고 NO의 대표적인 효능인 내피의존성 혈관이완에 미치는 효과 (eNOS에 미치는 영향)와 내피 비의존성 혈관이완에 미치는 효과를 검색하여 NO 기능연구에 사용가능한 시험약물, 나아가 혈관 이완 억제제로서의 활용이 기대되는 약물을 동시에 검색하고자 하였다. 또한 이 화합물들 lipopolysaccaride (LPS) 투여 흰쥐의 혈관이완 에 미치는 영향을 검색하여 iNOS에 미치는 영향을 시험함으로서 패혈증, 염증성질환 등에 활용이 기대되는 약물을 검색해 보고자 하였다. 또한 시험결과 얻은 화합물의 혈관이완 효력 결과 흰쥐 뇌중 NO 생성(nNOS)에 미치는 영향을 상호 비교하여 정상적인 혈압유지 및 혈류에는 영향을 주지 않고 뇌중 NO 생성만을 선택적으로 저해하는 nNOS selective inhibitor로서의 가능약물을 찾고자 하였다. 이와 함께 기존의 NO 활성에 대한 보고가 전무한 새로운 구조의 quinone계열 신합성 후 보물질들에 대한 흰쥐 뇌중 NO 생성에 미치는 영향을 한층 면밀하게 시험하여 퇴행성 뇌질환 등에 활용가능한 약물로서의 가능성을 밝히고자 하였다. 새로 합성된 6-arylamino-5,8-quinolinedione 유도체 (SA 계열),6-arylamino-5,8-quinazolinedione 유도체 (SB 계열), 7-arylamino-5,8-quinazolinedione 유도체 (SD 계열) 및 6-arylamino-2-(2-pyridyl)-4,7-benzimidazoledione 유도체 (SE 계열)에 대하여 혈관이완 억제 효능을 시험한 결과, quinazolinedione 유도체 SB 및 SD 계열 화합물중 acetylcholine(ACh)에 의한 내피의존성 혈관이완 뿐 아니라, sodiumnitroprusside에 의해 외부 공급된 NO에 의한 내피 비의존성 혈관이완에 대해서도 강한 억제작용을 보이는 화합물들이 검색되었으며, 이 화합물들은 또한 내독소인 LPS가 투여된 in vivo LPS 투여 패혈증 모델에서 arginine에 의한 혈관이완반응에도 억제효과를 나타냈다. 이 결과로부터 이 화합물들이 iNOS 저해효과가 우수하고 따라서 패혈증이나 조직괴사, 류마티스성 관절염 및 골관절염 등을 포함하는 염증성 질환 치료제의 후보물질로서 가능성을 기대할 수 있을 것으로 사료된다. 혈관이완 억제 효과 검색결과로부터 혈관 이완에 강한 억제효능을 보인 화합물, 중간 정도의 억제효능을 보인 화합물, 거의 억제효과를 보이지 않은 화합물을 분류하여 이 물질들의 흰쥐 뇌 NO 생성억제 효과를 측정하여 두 효과간의 상관성을 연구한 결과, 6-arylamino-2-(2-pyridyl)-4,7-benzimidazoledione (SE 계열) 유도체 12종 화합물은 모두 0.1 μM 농도로 행해진 혈관 이완 효능 검색 실험에서 ACh에 의한 내피 의존적인 혈관 이완을 거의 억제하지 못하였으나, 뇌 내 NOx 형성에 대해서는 10 μM 농도에서 40 ~ 64 %에 해당하는 강한 억제 효과를 나타내었다. 이 계열 약물군은 정상적인 혈압유지기능에는 영향을 주지 않으면서 nNOS에 작용하여, 급만성 퇴행성 신경질환 치료제 등으로 개발 가능한 선택적인 nNOS 저해제로서의 가능성이 기대된다. 앞에서 조사한 quinone 화합물들과 다른 모핵구조를 가지며 기존의 NO 활성에 대한 보고가 전혀 알려져 있지 않은 새로운 모핵구조의 신합성 quinone 화합물인 5-hydroxynaphthalene-1,4-dione 유도체 (SF계열), 6-arylamino-2,3-dimethylquinoxaline-5,8-dione 유도체 (SG 계열) 및 3-(hydroxymethyl)-1-methyl-5-(phenylamino)-1H-indole-4,7-dione 유도체 (SH 계열)의 NOx 생성 억제 효능 검색 시험결과, SH 계열 전화합물은 nNOS 억제효과가 알려진 양성대조물질 7-nitroindazole(7-NI)에 비해 IC50값이 높았으나, SF 및 SG 계열 화합물중 일부는 7-NI에 비해 IC50값이 월등히 낮아 Potency가 더 높은 것으로 평가되었다. potency의 차이는 있으나 시험에 사용한 모든 화합물의 용량-반응관계가 성립하는 것으로 볼 때 NO 생성 저해 효능은 quinone 계열 화합물의 공통적인 효력으로 볼 수 있으며, 어떤 계열 화합물이냐에 따라 효력이 크게 대별되는 결과를 나타낸 것으로 볼 때, 일차적으로 모핵구조에 따른 NOx 생성 억제 효력의 상관성이 있음이 추정된다. 혈관이관억제 효능시험에서, 시험에 사용한 신합성 quinone 계열 약물과 NOS의 oxygenase 부위 결합하여 저해작용을 나타내는 NG-nitro-L-arginine (L-NNA) 및 NOS의 reductase 부위 결합하여 저해작용을 나타내는 diphenylendiodonium (DPI)와의 병용투여 시험결과, L-NNA 병용처치시 시험약물의 내피의존성 혈관이완 억제반응이 증강 되었고 DPI 병용에 의해서는 변화를 나타내지 않았고, 또한 시험약물의 soluble guanylate cyclase (sGC) 저해제 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a] quinoxalin- 1-one (ODQ) 와의 병용투여시 ODQ에 의해 상가적으로 증가된 억제활성을 나타낸 결과를 종합해 볼 때, 신합성 quinone 유도체는 내피 의존적인 혈관 이완 반응 뿐 아니라, SNP에 의해 외부 NO의 공급에 의해 유도되는 내피 비의존성 혈관 이완반응에 대해서도 세포 내 cyclicGMP 생성 억제를 경유하거나, 또는 NOS reductase와 결합하여 그 자체가 전자수용체로 작용하여cofactor NADPH를 통한 전자흐름을 억제하여 NO 생성을 직접적으로 저해하거나, 이전의 보고에서 추론한 것과 같이 NOS에 의한 반응결과 superoxide를 발생시켜 NO를 불활성화시켜 혈관 이완 억제 효과를 보이는 것으로 추정된다. 위의 결과를 종합해 볼 때 본 연구에서 시험한 신합성 quinone 화합물들은 NOS와 sGC를 저해함으로써 혈관이완 억제작용 등 효력을 나타내며, 시험에 사용된 일부 화합물들은 nNOS와 eNOS를 동시에 저해하지 않고 선택적 nNOS 저해제로의 가능성이 기대되는 등 협의로는 NO 기전연구를 위한 생화학적인 시험약물로서, 광의로는 퇴행성 신경질환 치료제로서의 개발 가능성이 있다고 사료되며, 내독소인 LPS가 투여된 in vivo LPS 투여 패혈증 동물모델에서 큰 효력을 보인 화합물들은 추후 구체적인 약리학적 기전 및 독성 연구 결과가 뒷받침될 때 패혈증 및 염증성 질환치료제 후보물질로서 그 가능성이 기대된다.